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毕赤酵母表达重组人溶菌酶的发酵工艺优化及傅里叶红外光谱仪在其过程底物控制中的初步应用研究

吴胜  
【摘要】:人溶菌酶(HLZ)是一种具有长远市场前景和应用价值的药物以及保健品。本文针对毕赤酵母表达重组人溶菌酶的生理代谢特性以及发酵优化策略展开了一定的研究,并对傅里叶红外光谱仪在毕赤酵母发酵过程中监测底物浓度的应用进行了初步地研究。 在摇瓶水平,采用响应面分析方法对毕赤酵母的培养条件进行优化,获得的溶菌酶酶活为4210U/mL。定量考察了渗透压对毕赤酵母生产溶菌酶的影响。研究发现渗透压的升高能抑制菌体的生长;在诱导前添加0.1mol/L的NaCl后,HLZ酶活对菌体的得率系数(Yp/x)由342.42U/g升高到383.36U/g;细胞膜中不饱和脂肪酸含量升高,饱和脂肪酸的含量降低,细胞膜流动性增强;脯氨酸作为外源可溶性物质添加到培养基中,能够减小渗透压对细胞生长的抑制作用,并在摇瓶和连续培养中分别提高酶活最终产量10.9%和17.4%。 在诱导阶段比较了甘油、山梨醇和乳酸分别作为除甲醇外的辅助碳源对毕赤酵母生长和表达的影响,发现采用山梨醇和甲醇混合流加后HLZ酶活有提高明显,摇瓶中酶活提高了7.6%,5L发酵罐发酵后酶活提高了12.3%,并且发现补充辅助碳源主要是通过提高乙醇氧化酶(AOX)酶活力和活细胞比率来提高相应的酶活水平;在30L发酵罐中考察了诱导初始菌浓和溶氧调控策略对表达溶菌酶的影响,发现初始菌浓为100g/L,维持诱导阶段的溶氧在5-15%之间有利于人溶菌酶的表达,并依此结果优化30L发酵罐中人溶菌酶的发酵工艺。 在毕赤酵母发酵生产重组人溶菌酶过程中,利用衰减全反射-傅里叶红外光谱法(ATR-FTIR)结合偏最小二乘法(PLS)建立发酵底物甘油和甲醇的预测模型,该模型具有良好的稳定性和预测性,甘油预测模型的校正标准偏差(SEC)和验证标准偏差(SEV)分别为0.171和0.532g/L,甲醇预测模型的SEC和SEV分别为0.129和0.248g/L在5L发酵罐中运用建立的模型预测发酵液中甘油和甲醇的浓度,预测标准误差(SEP)分别为1.09和0.86g/L,表明模型稳定,能有效指导实际生产;分别比较采用FTIR调控和溶氧(DO-stat)调控甲醇浓度策略下的比生长速率(μ)和比生产速率(Qp),结果表明FTIR调控下比生长速率和比生产速率均高于溶氧(DO-stat)调控;结合国家仪器仪表科技支撑计划项目,初步考察了自制红外光谱仪样机的性能。


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