日本血吸虫氧化还原相关蛋白功能、结构及应用研究

【摘要】：血吸虫病是由血吸虫感染引起的一种严重威胁人类健康的寄生病,我国流行的主要是日本血吸虫病。截至目前,临床上还没有有效的预防血吸虫病的疫苗,治疗药物也仅限于吡喹酮1种,而且已经使用了近40年。长期的单一用药难免会诱导抗药性虫株的出现,因此亟待开发新的抗虫疫苗或药物用于血吸虫病的防治。疫苗或药物的开发依赖于对血吸虫自身代谢途径及其与宿主相互作用机制的深入了解。近年来,血吸虫氧化还原代谢途径或氧化还原相关蛋白日益引起人们的重视,这是因为氧化还原过程对于虫体自身的能量供给、基因调控、细胞生长分化以及帮助虫体有效的逃避宿主免疫系统产生的活性氧侵害等具有十分重要的意义。本研究选定了3个日本血吸虫氧化还原相关蛋白,并对其功能、结构和应用进行了深入探讨。在日本血吸虫醛糖还原酶(SjAR)的研究中,克隆、表达和纯化了重组的SjAR蛋白,建立了其体外酶活测定方法。以SjAR为药物靶点的研究中,首先解析了SjAR的三级结构,随后应用分子对接技术从Maybridge化合物库中筛选出10种小分子用于体外杀虫活性测试。实验结果显示其中1种化合物AR9具有很好的杀虫活性,半数致死剂量LD50值为(5.48±2.38)μg/ml;进一步靶点确认证实它能够抑制重组SjAR的活性,其半数抑制浓度IC50值约为11.75 μg/ml;细胞毒性测试显示该化合物对宿主细胞的毒性较小,提示其可作为治疗血吸虫病的先导化合物,指导后续抗虫新药的开发。此外,本研究也评估了SjAR作为抗血吸虫疫苗的潜质,结果显示重组SjAR蛋白免疫后的小鼠较佐剂组相比,成虫数减少了32.9%(P0.01),肝脏和粪便中虫卵数也相应减少28.3%(P0.05)和42.8%(P0.05),提示SjAR具备成为血吸虫候选疫苗的潜质,值得深入研究。功能研究方面,转录水平上雄虫SjAR的水平要明显高于雌虫,进一步的组织定位显示SjAR在雄虫的抱雌沟处丰度较高,说明SjAR很可能是一种性别差异表达蛋白。在日本血吸虫3-氧化酰基-酰基载体蟹白还原酶(SjOAR)的研究中,克隆、表达、纯化了重组的SjOAR蛋白,建立了体外酶活的测定方法,测定了其动力学参数,并进一步证实其酶促反应动力学为序列机制。在以SjOAR为药物靶点的研究中,首先用同源模建的方法构建了SjOAR的三维结构,随后同样使用分子对接技术从Maybridge化合物库中筛选出27种小分子用于后续的BIAcore分析和体外杀虫活性测试。BIAcore分析结果显示27种化合物均能够与SjOAR发生不同程度结合,部分化合物的解离常数KD可达10 μM,结合能力最好的OAR27可达1.85×10μM。体外杀虫活性测试结果显示OAR19、OAR22和OAR273种化合物具有明显的杀虫效果,其半数致死剂量LDso值分别为(19.7±8.7)μg/ml, (18.0±7.6)μg/ml和(18.5±6.1)μg/ml。为了证实这3种化合物确实以SjOAR为靶点,本研究又测试了它们对重组SjOAR活性的抑制,结果显示OAR22和OAR27均能够在不同程度上抑制SjOAR的活性[IC50值分别为80μg/ml和(21.79±1.33)μg/ml],而OAR19则不能抑制SjOAR的活性。说明OAR19的作用靶位并不是SjOAR,而OAR22和OAR27则可能通过抑制SjOAR的活性来实现其干扰虫体生命活动以致杀虫的目的。细胞毒性测试结果显示,OAR19细胞毒性较大,OAR27次之,OAR22最小。此外,鉴于SjOAR具有很好的免疫原性,本研究也评估了重组SjOAR作为抗虫疫苗的价值,结果显示SjOAR能够诱导感染日本血吸虫的小鼠产生部分减虫率和减卵率,但不具有统计学意义。免疫荧光定位结果显示,SjOAR主要位于虫体的内部,且丰度较高。在日本血吸虫硫氧还蛋白-1 (SjTrx-1)的研究中,克隆、表达和纯化了SjTrx-1重组蛋白,并测定了其体外的酶催化活性。以SjTrx-1作为药物靶点的研究中,发现之前报道的硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶(TGR)的抑制剂金诺芬同样能够抑制SjTrx-1的活性,说明血吸虫中TGR并不是金诺芬作用的唯一靶点。金诺芬杀虫活性测试结果显示,它具有非常好的体外杀虫效果,而且其对成虫的效果要好于童虫。细胞毒性测试结果显示金诺芬在杀虫浓度下(5 μg/ml)具有显著的细胞毒性,这与以往研究显示细胞能在100μM的金诺芬(约68 μg/ml)浓度下存活5天的结果不一致,本研究对上述结果提出质疑。免疫荧光定位结果显示,SjTrx-1在虫体内的分布比较广泛,且丰度较高。综上,本研究综合运用生物信息学、分子生物学、蛋白酶学、结构生物学以及免疫学等多种方法,对日本血吸虫3种氧化还原相关蛋白的功能、结构和应用研究进行了深入探讨,研究结果对血吸虫病的预防和治疗有一定的借鉴意义。