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开发酶的底物非特异性转化多羟基化合物生产1-烷醇和1,n-烷二醇的研究

戴璐  
【摘要】:1-烷醇和1,n-烷二醇(C4-C6)作为重要的的通用化学品,在能源、化工和材料等领域具有广泛的应用,然而它们大多不能由微生物自发的合成,开发1-烷醇和1,n-烷二醇的人工途径具有重要的意义。多羟基化合物在自然界中广泛存在,且它们具有和1-烷醇及1,n-烷二醇相似的结构,这激发我们寻找能够减少多羟基化合物中的羟基数目的酶,从而实现从多羟基化合物到1-烷醇和1,n-烷二醇的生物转化。鉴于甘油脱水酶和二醇脱水酶在1-丙醇和1,3-丙二醇的合成中起着重要作用,因此本课题从甘油脱水酶和二醇脱水酶出发,利用蛋白质工程开发其底物非特异性,实现了从长碳链多元醇到1-烷醇和1,n-烷二醇的生物转化。以下是本论文的主要内容和结论:首先,研究了甘油脱水酶和二醇脱水酶催化四碳多元醇的潜能。异源表达了四个不同来源的脱水酶,结合酶学实验和产物检测证实了脱水酶无法有效催化赤藓糖醇。然后对其中两个脱水酶进行突变,获得了 1,2,4-丁三醇催化活性显著提高的突变体,并且利用全细胞催化证实了从1,2,4-丁三醇到1,4-丁二醇转化的可行性。其次,研究了甘油脱水酶和二醇脱水酶催化1,2-丁二醇、1,2,4-丁三醇、赤藓糖醇、1,2-戊二醇、1,2,5-戊三醇和1,2,6-己三醇的潜能。体外酶学实验和产物检测证实野生型甘油脱水酶可以催化1,2,5-戊三醇,野生型二醇脱水酶能够催化1,2-戊二醇和1,2,5-戊三醇。将两个脱水酶突变后,突变体催化上述六种多元醇的能力均有不同程度的增强。第三,在大肠杆菌中构建了从赤藓糖醇到1,4-丁二醇,从1,2-戊二醇到1-戊醇和从木糖到1,4-丁二醇的生物途径。其中含有甘油脱水酶突变体的三条途径分别生产16.1 mg/L 1,4-丁二醇,12.8 mg/L 1-戊醇和48.9 mg/L 1,4-丁二醇;含有二醇脱水酶突变体的三条途径分别生产 11.9 mg/L 1,4-丁二醇,137.8 mg/L 1-戊醇和 51.8 mg/L 1,4-丁二醇。此外,测定甘油脱水酶和二醇脱水酶催化1,2,4-丁三醇的动力学参数,其中甘油脱水酶突变体和二醇脱水酶突变体的Km值分别为34.14 mM和1.04 mM;二者的kcat值分别为0.21 s-1 和 0.39 s-1。最后,进一步研究甘油脱水酶催化四碳多元醇的特性。首先研究菌体浓度、温度、底物浓度和pH对重组菌转化赤藓糖醇合成1,4-丁二醇的影响。结果显示,1,4-丁二醇的浓度随菌体浓度、底物浓度的增加呈现先上升后下降的趋势,低温和弱碱性对1,4-丁二醇的合成有利。在最佳条件下,1,4-丁二醇的浓度为34.5 mg/L,相比于未优化条件,产物浓度上升了近6倍。然后研究甘油脱水酶催化赤藓糖醇异构体的活性和1.2,4-丁三醇异构体的动力学特性,证实突变体催化L-苏糖醇的酶活显著高于赤藓糖醇和D-苏糖醇。突变体对三种1,2,4-丁三醇具有相似的催化速率,但是对(R)-1,2,4-丁三醇的Km值明显高于(S)-1,2,4-丁三醇和1,2,4-丁三醇,这些数据将为后续的计算机模拟提供数据支持。许多重要化合物由于缺乏相关的酶,无法实现生物合成,因此构建其代谢途径的关键是挖掘基因,而开发酶的非特异性是一种有效的策略。本课题从甘油脱水酶和二醇脱水酶出发,对其底物非特异性进行研究,并利用蛋白质工程提高其催化长碳链多元醇的活性,为合成生物学提供更多的基因元件,同时为1-烷醇和1,n-烷二醇的生物转化提供更多的选择。


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