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高产木质纤维素手性乳酸的乳酸片球菌全糖代谢路径构建与抗逆性强化改造

邱忠洋  
【摘要】:木质纤维素生物质中的纤维素由葡萄糖组成,半纤维素由木糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖等多种单糖组成,其中半纤维素来源的单糖约占木质纤维素总糖的40%(w/w)。对木质纤维素来源全糖(葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖)的有效利用是生物炼制技术的关键科学问题之一,然而目前的木质纤维素手性乳酸发酵研究中,从菌种改造到发酵技术,仍未给出具有实际工业应用价值的有效解决方案。另外,生物炼制过程中的预处理过程不可避免的会产生呋喃类、弱酸类和酚醛类等诸多抑制物,这些抑制物的彻底脱除是木质纤维素发酵正常进行的前提。本文依托由干酸预处理、生物脱毒、高固含量同步糖化与发酵构成的干法生物炼制平台,以高产木质纤维素手性乳酸为目标,对上述两个关键科学问题进行了研究。干酸预处理后得到的干固颗粒状木质纤维素物料,经过生物脱毒可快速脱除物料中的呋喃类和弱酸类抑制物,同时有效保留了预处理过程产生的木糖、阿拉伯糖等半纤维素来源的戊糖,为后续己糖-戊糖共发酵菌株改造,以及同步糖化与己糖-戊糖共发酵提供了重要的前提条件。另一方面,经干酸预处理和生物脱毒后的木质纤维素原料中仍有酚醛存在,并对高浓度和高产率的手性乳酸发酵产生了显著的负面影响。实验室前期工作中,从纤维素乙醇发酵醪中筛选到一株对木质纤维素水解液具有特殊适应性的耐高温野生型乳酸菌Pediococcus acidilacticiDQ2,分别敲除了基因组中的ldhD和ldh基因,并进行了适应性进化,构建得到了 L-乳酸高产菌株P acidilactici TY112 和 D-乳酸高产菌株 P.acidilactci ZP26。然而,P.acidilactici工程菌仍存在两个缺陷,一是只能利用葡萄糖和半乳糖等己糖,而不能有效利用木糖和阿拉伯糖等戊糖,二是对酚醛抑制物耐受性较差。本文以上述两株手性乳酸生产菌株为研究对象,通过代谢工程手段实现了P.acidilactici的全糖代谢及酚醛抗逆强化,并利用干法生物炼制平台进行了高固含量同步糖化与全糖共发酵(SSCF),最终获得了目前木质纤维素手性乳酸发酵的最高指标。第一部分,通过代谢工程将异源木糖代谢路径构建至 P.acdilacticiZP26基因组中,从而构建得到了可共发酵葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖(全糖发酵)的工程菌株,并实现了木质纤维素的高固含量SSCF生产高指标D-乳酸。P.acidilactici ZP26缺乏木糖代谢路径,且代谢阿拉伯糖和甘露糖时的D-乳酸得率较低。本研究将异源木糖代谢路径关键酶的编码基因木糖异构酶(xylA)、木酮糖激酶(xylB)、转酮醇酶(tkt)及转醛醇酶(tal),全部整合至P.acidilactici ZP26的基因组中,并敲除了磷酸转酮酶路径(PK路径)的磷酸转酮酶编码基因pkt,切断了代谢木糖时乙酸的生成,并通过适应性进化显著提高了工程菌株的木糖代谢速率。另外,木糖代谢路径的构建对葡萄糖和半乳糖的代谢没有负面影响,但显著提高了阿拉伯糖和甘露糖代谢时的D-乳酸得率,从而构建得到了可高效全糖共发酵进行同型D-乳酸生产的稳定菌株P.acidlactici ZY15,光学纯度达到99.2%。并以干酸预处理和生物脱毒后的小麦秸秆为原料,进行了高固含量SSCF,其中D-乳酸浓度、产率和得率分别为127.1 g/L、1.8 g/L/h和62.3%,且残留的单糖总量只有1.6 g/L,这一发酵指标是目前利用木质纤维素进行D-乳酸生产的最高水平。第二部分,通过代谢工程将异源木糖代谢路径构建至L-乳酸生产菌株P.acidilactici TY112基因组中,从而获得了可以全糖发酵生产L-乳酸的工程菌株,并实现了木质纤维素的高固含量SSCF生产高指标L-乳酸。P.acidilactici TY112缺乏木糖代谢路径,且代谢阿拉伯糖和甘露糖时的L-乳酸得率较低。本研究基于第一部分的木糖代谢路径构建策略,首先将异源基因xylA、xylB和tal整合至P.aciilacticiTY112的基因组中,并敲除pkt及乙酸激酶编码基因ackA2以阻断乙酸生成;接着,通过适应性进化显著提高了工程菌株的木糖利用速率。而且,木糖代谢路径的构建显著提高了阿拉伯糖和甘露糖代谢时的L-乳酸得率,但没有对葡萄糖和半乳糖代谢造成负面影响,从而构建得到可共发酵五种单糖进行同型L-乳酸生产的工程菌株P.acidilactici ZY271,光学纯度达99.6%。最后,本研究使用经干酸预处理、生物脱毒的小麦秸秆为原料,进行了高固含量SSCF,其中L-乳酸浓度、产率和得率分别为126.7 g/L、1.8g/L/h和62.3%,且残留的五种单糖总量只有1.1g/L,这一发酵指标是目前木质纤维素L-乳酸生产的最高水平。第三部分,通过对P.acidilactici ZY15的酚醛转化路径进行了强化,从而减弱了酚醛抑制物对发酵过程的抑制作用。本研究首先对P.acidilactici ZY15的4-羟基苯甲醛、香草醛和丁香醛的抗逆性进行了评价,发现香草醛是抑制能力最强的关键酚醛抑制物。将异源的短链脱氢酶编码基因CGS914_RS09725在P.acidilacici ZY15基因组中进行了整合表达,显著加强了P.acidlactici ZY15在香草醛胁迫下的发酵性能,从而得到香草醛抗逆强化菌株P.acidilacti ZY15-△ackA2::CGS9114_RS09725。最后使用经干酸预处理和生物脱毒后的玉米秸秆为原料,对P.acidilacticiZY15-△ackA2::CGS9114_RS09725和出发菌株P.acidilactici ZY15的SSCF性能进行了比较,前者由于对香草醛具有更强的抗逆性,其发酵性能明显优于后者。综上所述,为实现木质纤维素全糖代谢及解除酚醛抑制物对手性乳酸生产菌株的抑制作用,首先,本论文结合代谢工程和适应性进化,将木糖代谢路径构建至手性乳酸生产菌株P.acidilactici中,从而得到两株可高效共发酵葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖进行手性乳酸生产的工程菌株P.acidilactici ZY15(D-乳酸)和P.acidilactici ZY271(L-乳酸),并利用木质纤维素原料进行了高固含量SSCF生产高指标手性乳酸。其次,通过基因组整合异源短链脱氢酶编码基因,显著加强了P.acidilactici ZY15的香草醛抗逆能力,实现了酚醛胁迫下的高指标木质纤维素D-乳酸发酵。本论文为木质纤维素生物炼制提供了具备全糖代谢及酚醛抗逆的手性乳酸高产菌株。


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