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龟裂链霉菌双组份系统RimA1A2和AfrQ1Q2调控土霉素生物合成研究

倪辉  
【摘要】:土霉素(oxytetracycline,OTC)是一种四环类广谱抗生素,属于典型的Ⅱ型聚酮类化合物。龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus,S.rimosus)是土霉素合成的主要商业化生产菌株,从其基因组信息中发掘与细胞生长和土霉素生物合成相关的调控基因,完善土霉素生物合成的调控网络将有助于指导土霉素的发酵过程调控。双组份系统(two component system,TCS)作为一类全局调控因子,对于链霉菌的生长、孢子形成以及次级代谢产物的合成都有调控作用。目前,在链霉菌中绝大多数的双组份系统研究都集中于天蓝色链霉菌(S.coelicolor)中,针对S.rimosus中双组份系统的研究仍然不系统。为此,本论文开展三方面的研究:(1)对S.rimosus M4018进行基因组测序,挖掘其中的双组份系统信息;(2)分别研究双组份系统RimA1A2和AfrQ1Q2与土霉素合成之间的调控途径,阐明其对土霉素生物合成的调控网络;(3)针对OTC发酵过程高耗氧的特性,开展了血红蛋白在S.rimosus中表达的相关研究,考察其对S.rimosus M4018的生长以及土霉素合成的影响。具体结果如下:1.S.rimosus基因组测序、双组份系统的分类和鉴定首先通过基因组测序完成了S.rimosus M4018的基因组草图,测得的S.rimosus M4018的基因组大小约为9.2 Mb左右,其中存在假定的编码蛋白的基因数量为8584个。将其中所有ORF蛋白序列与PFAM数据库进行比对,发现77个假定的响应调节蛋白(response regulator,RR)以及 171个假定的组氨酸激酶(histidine kinase,HK)。根据HK和RR的特性,初步确定了 50对典型的双组分调控系统。通过基因组序列分析,在S.rimosus M4018基因组中找到两个与S.coelicolor中已知的双组份系统同源性较高的假定双组份系统,将其分别命名为RimA1A2和AfrQ1Q2。通过氨基酸序列比对保守功能域,证明了S.rimosus M4018中的RimA1A2和AfrQ1Q2是典型的双组份系统。RT-PCR证明这两个新发现的双组份系统的HK和RR编码基因都是共转录。2.培养基依赖条件下,RimA1A2和AfrQ1Q2负调控土霉素的合成构建rimA1基因阻断菌S.rimosus M4018 ΔrimA1和afrQ1基因阻断菌S.rimosus M4018 ΔafrQ1。发现在常用的复合培养基条件下,M4018 ΔrimA1、M4018 ΔafrQ1与出发菌M4018在孢子形成、色素产生和土霉素合成方面并没有明显的差异。但是,当以基本培养基(minimal medium,MM)为基础,以不同氨基酸为唯一氮源后,发现M4018ΔrimA1、M4018 ΔafrQ1相较于M4018 土霉素产量都有显著提高。在以甘氨酸(glycine,Gly)为唯一氮源的MM条件下,OTC产量提高幅度最为明显。表明在培养基依赖条件下,双组份系统RimA1A2和AfrQ1Q2对于S.rimosus中土霉素的合成是负调控。3.胁迫条件下,双组份系统RimA1A2与土霉素合成之间的关系成功构建双组份系统的回补菌M4018 ArimA1(pIB-KA-rim),过表达菌M4018(pIB-KA-rim)以及各自对应的空质粒对照菌株。首先以MM+Gly为培养条件,发酵实验发现实验组和对照组之间基本无OTC合成差异,排除了可能由基因操作引起的极性效应。而在MM+Gly培养基中额外添加H2O2后的氧化胁迫环境下,发现RimA1A2双组份系统的失活能够帮助菌体抵御一定程度的氧化胁迫,相较于同样环境的出发菌,获得更高的产素水平。而在培养基中额外添加氯化钾后的高渗透压环境中,RimA1A2双组份基因的阻断失活,与出发菌相比,其土霉素合成水平的下降幅度反而增大,这一点与双氧水胁迫条件下的作用相反。4.胁迫条件下,双组份系统AfrQ1Q2与土霉素合成之间的关系构建 AfrQ1Q2 回补菌株S.rimosus M4018 △afrQ1(pIB139-KA-afr)和过表达菌株S.rimosu s M4018(pIB139-KA-afr)。在MM+Gly培养基中额外添加H2O2后的氧化胁迫环境下,双组份系统AfrQ1Q2的失活,有利于菌体应对氧化胁迫的不利条件,缩小M4018-△afrQ1的产素水平下降幅度。而将MM+Gly中葡萄糖的初始浓度由1%提高至8%时,发现AfrQ1Q2的失活能帮助菌体在高糖浓度的压力环境下缩小土霉素产量下降的幅度。5.双组份系统RimA1A2和AfrQ1Q2调控土霉素合成的方式为了阐明双组份系统与土霉素合成水平之间的关系,分别在rimA1阻断菌和afrQ1阻断菌中,测定一合成基因oxyB和otrB,otrC,otcG、otcR四个正调控基因的转录水平,发现这五个基因的转录分别有不同程度的提高,这一结果符合实际发酵中土霉素水平提高的结果。由此表明了双组份系统RimA1A2和AfrQ1Q2是多效调控因子,通过影响土霉素基因簇上的合成和调控基因,最终实现对OTC合成的调控。6.透明颤菌血红蛋白基因在龟裂链霉菌中的表达及其对土霉素合成的影响以整合型质粒pSET152为基础,构建由红霉素抗性基因启动子PermE*组成型表达透明颤菌血红蛋白基因的质粒pSET1 52-PermE*-vgb(pEV),并将该质粒整合到土霉素合成菌株S.rimosus M4018中。重组龟裂链霉菌中VHb蛋白的表达提高了菌株对氧的亲和力,在正常高氧与限氧条件下均可促进了土霉素的生物合成,而且显著改善了菌株在低氧条件下的生长。


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