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乳酸片球菌的全糖代谢能力探究及抗逆性强化改造

方纯  
【摘要】:木质纤维素组成成分中纤维素来源的己糖主要是葡萄糖,半纤维素来源的己糖为半乳糖和甘露糖,戊糖主要为木糖和阿拉伯糖。其中木糖和阿拉伯糖约占木质纤维素总单糖的30-40%,半乳糖和甘露糖占总单糖的1%左右。首先,全糖的高效利用是木质纤维素生物炼制的重点问题之一,发酵菌株中普遍存在葡萄糖抑制作用,即当葡萄糖存在时只能优先利用葡萄糖,待耗完后再利用其它单糖,从而导致发酵菌株在进行全糖发酵时非葡萄糖单糖的利用率偏低,在近期关于木质纤维素乳酸发酵的研究工作中并未探究出缓解葡萄糖抑制作用的有效解决方案。其次,生物炼制的预处理过程中会产生呋喃类、酚类和弱酸类等多种抑制物,通过生物脱毒技术可以快速的将呋喃类和弱酸类抑制物脱除,但难以有效脱除酚类抑制物,延长脱毒时间可以将酚类抑制物脱除完全,但会损失葡萄糖和木糖等单糖进而降低后期的发酵指标。另外,预处理过程中富集的金属离子也是一类主要的抑制物,其中钠离子是整个生物炼制技术进行pH调控所富集的典型金属离子,在一定浓度范围内会严重抑制菌株的发酵性能。本文针对上述三个关键问题进行了探究。利用实验室前期构建的具有木糖代谢路径的L-乳酸生产菌株P.acidilactici ZY271和D-乳酸生产菌株P.acidilactici ZY15,在五种单糖及混合糖体系下探究了两株菌株的全糖利用能力,并且从糖代谢和糖转运相关基因的转录水平对发酵现象进行了初步分析。其次,通过基因工程,实现了P.acidilactici酚类抑制物和钠离子的抗逆性强化。基于以上实验探究,最终为高指标木质纤维素乳酸及乳酸钠发酵提供了有效菌株。第一部分,利用构建了木糖代谢路径的L-乳酸生产菌株P.acidilactici ZY271和D-乳酸生产菌株P.acidilactici ZY15,分别进行了五种单糖(葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖)和混合糖的发酵评价,为了进一步提高构建菌株对糖的利用以及糖代谢速率,我们进行了混合糖的驯化。从发酵现象中可得,两株构建菌株可以实现全糖利用且不存在葡萄糖抑制作用,即可同步代谢多种单糖,并且木糖代谢路径的构建提高了菌株对于甘露糖的代谢速率。针对这两个主要的发酵现象,本研究从糖代谢和糖转运蛋白两方面进行了相关基因的转录水平分析,发现编码甘露糖PTS转运系统中的EIIMan蛋白的manXYZ基因簇对糖的高效利用起到关键作用,对相关基因进行进一步探究,可运用在其他菌株中,为其他菌株对糖的高效利用提供基因来源。第二部分,通过基因工程,实现了P.acidilactici ZY15对酚类抑制物的抗逆性强化。本研究首先对P.acidilactici ZY15的酚类抑制物(4-羟基苯甲醛、香草醛、丁香醛和苯醌(BQ))耐受性进行了探究,可以得到香草醛对P.acidilactici ZY15的抑制作用最强,而实验室在前期工作中已经探究出P.acidilactici ZY15不具备降解BQ的能力,且菌株对醌类化合物较为敏感。之后将筛选出来的酚醛耐受有效基因CGS9114_RS09725和BQ降解有效基因ZMOO1116分别整合到了P.acidilactici ZY15基因组中,在相应的酚类抑制物胁迫的环境下,P.acidilactici ZY15-Δ ackA2::CGS9114 RS09725提高了对香草醛的转化能力且发酵性能得到显著加强,P.acidilactici ZY15-ΔackA2::ZMO1116具备了 BQ降解途径,可以实现对BQ的转化并且最终的发酵性能也得到了提升。最后以玉米秸秆为原料进行SSCF,与原始菌株P.acidilacticiZY15相比较,两株整合菌株的发酵性能都优于原始菌株。第三部分,通过基因工程,提高了P.acidilactici ZY271对于钠离子的耐受能力。本研究首先对P.acidiactici ZY271的钠离子耐受能力进行了探究,发现一定浓度(约25 g/L)的钠离子可完全抑制P.acidilactici ZY271的生长活性。将编码Na+/H+逆向转运蛋白的基因Na+/H+antiporter_RS02775在P.acidiactici ZY271中进行过表达,在Na+浓度较高的胁迫环境下,相对于原始菌株,重组菌株P.acidilactici ZY271(pZY36e-RS02775)的糖代谢能力和乳酸钠的产量均有所提高。最后以麦秆为原料进行了 SSCF,使用NaOH溶液(13.5 M)作为pH中和剂,与原始菌株P.acidilactici ZY271相比较,工程菌株的乳酸钠发酵指标有了明显提高。综上所述,本研究以已构建木糖代谢路径的两株P.acidilactici为实验对象,探究了两株构建菌株的全糖利用能力,并针对全糖利用的发酵现象进行了初步的分子机制的分析;经基因工程改造有效提高了P.acidilactici对于酚类抑制物的抗逆性以及钠离子的耐受能力。本研究为可发酵单糖的高效利用提供了具有参考价值的基因,以及为高指标的木质纤维素乳酸及乳酸钠发酵提供了有效菌株。


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