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王浆主蛋白的分离提取及其对非酒精性脂肪肝预防效果研究

张晓晨  
【摘要】:非酒精性脂肪肝(NAFLD)是世界上最常见的一种慢性肝病,其主要特征是脂质代谢障碍和氧化应激加剧,寻找能够预防NAFLD发生的天然产物成为现今辅助治疗NAFLD的重要发展趋势。本文以蜂王浆样品中的主要活性物质——王浆主蛋白(MRJPs)为研究对象,优化其提取工艺,并在此基础上利用油酸(OA)构建体外肝细胞脂积累模型和HepG2细胞线粒体功能障碍模型,探究MRJPs预防NAFLD发生的作用机制,旨在为开发高附加值的肽类药物提供依据。主要研究成果如下:(1)采用离心透析法从蜂王浆中提取MRJPs,所得最佳工艺提取条件如下:提取液液料比8:1 mL/g、提取液pH值为7、提取时间4 h、透析时间24 h。在最佳工艺条件下,每2.5 g的蜂王浆中能提取得到0.314±0.051 g的MRJPs,平均得率为12.56%。(2)通过SDS-PAGE鉴定出 MRJPs中的主要成分为MRJP5(72kDa)、MRJP4(68kDa)、MRJP3(64kDa)、MRJP1(57kDa)和 MRJP2(49kDa),且超高速离心法所得的结果进一步证实MRJP1是MRJPs的主要成分。(3)采取 1.00 mmol/L 的 OA 孵育 HepG2 细胞 24 h 或 0.50 mmol/L 的 OA 孵育 L02细胞24 h均能有效构建体外肝细胞脂积累模型,该模型细胞质内出现大量脂滴且脂滴积聚明显,细胞内甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)含量升高、超氧化物歧化酶(SOD)活力降低,培养基中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)含量升高,而提前使用0.2、0.5、1.0 g/L的MRJPs预孵育这两种细胞24 h所得结果同模型组相比,细胞质内脂滴积聚减少,细胞内TG和TC含量降低,SOD活力升高,培养基中ALT/AST含量降低。这说明MRJPs能预防脂代谢障碍和肝细胞氧化应激。(4)采取0.50 mmol/L的OA孵育HepG2细胞48 h能有效构建体外线粒体功能障碍模型,该模型细胞线粒体膜电位(MMP)降低,三磷酸腺苷(ATP)含量减少,而提前使用0.2、0.5、1.0 g/L的MRJPs预孵育HepG2细胞24h能维持HepG2细胞正常的MMP和ATP含量。这说明MRJPs能预防线粒体功能的完备性受损。(5)采用0.50 mmol/L的OA孵育HepG2细胞48 h能有效降低沉默调节蛋白3(SIRT3)、线粒体超氧化物歧化酶(SOD2)、细胞色素C氧化酶IV(COXIV)的mRNA及蛋白的表达量,且在一定程度上能够抑制单磷酸腺苷依赖的蛋白激酶(AMPK)的磷酸化,而提前使用0.2、0.5、1.0g/L的MRJPs预孵育HepG2细胞24h能上调SIRT3、SOD2、COXIV的mRNA及蛋白的表达量,同时抑制SIRT3的表达将会阻碍MRJPs发挥预防作用。这说明MRJPs介导的SIRT3表达上调及其下游SOD2与COXIV的表达上调可能是MRJPs发挥其预防NAFLD的关键环节,而AMPK信号通路可能是MRJPs上调SIRT3表达的一条重要途径和分子基础。


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