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猪主动脉冻干理论研究及移植应用

刘萌芳  
【摘要】:对于严重的心血管疾病治疗,除药物治疗外,血管移植修复是治疗此类疾病的有效方法。在移植材料的选择上,天然的生物组织材料能够克服人工材料技术及功能方面的诸多不足,而对生物材料的处理和保存一直是备受关注的难题。本课题采用真空冷冻干燥技术处理猪主动脉血管,冻干后的血管在物理性能、力学性能和组织结构的保持等方面具有其独特的优势,同时尝试手术同种异体移植冻干血管及冻干脱细胞血管,研究和评估冻干技术制备血管支架的可行性,期望为临床救治相关疾病提供优质可靠的移植血管材料。 在多次对猪主动脉血管冷冻干燥后发现,冻干后的管壁有明显的皱缩变薄现象,这说明血管的内部结构发生了塌陷和破坏,因此课题首先对真空冷冻干燥的方法进行了优化研究,经多次实验方案的调整,辅以表面观察,Micro-CT扫描内部结构、计算孔隙率并构架三维空间结构图,验证冻干血管的结构变化程度,找到了冻干血管的优化方法,解释和分析造成样品皱缩的原因,并指出,一次干燥终点的判断对干燥样品的品质影响很大。经优化方法冻干的血管,塌陷及皱缩现象得以消除,冻干后的样品孔隙率约为34.42%,脱水率约为70.91%,复水能力约为2.37,优于通常方法得到的孔隙率29.26%、脱水率70.37%及复水能力2.28,实验同时用真空干燥的方法测得猪主动脉血管的含水量为(72.010.50)%; 理论研究的另一方面,是使用FLUENT软件对快速冻结的血管温度变化进行了过程模拟,与实际记录结果对照,发现血管在零上温度降温时的温度变化模拟与实际较为接近,零下温度冻结的模拟有一定偏差但趋势基本一致;冻结时血管与周围环境的对流换热及辐射换热的相互影响造成血管的温度(-40~-44℃)不能达到搁板温度(-70℃),文中估算出从开始冻结直至最低温度的过程中,血管与外界的相互换热量约为1273.5J;一次及二次干燥过程,以半小时为间隔单位,计算整个干燥阶段血管中水分的实际升华潜热、血管质量的前后变化,将实际的升华潜热计算结果同纯水冰相的升华潜热比较,并与质量差的分析相结合,阐示出干燥界面的移动、水分逸出的路径、各阶段逸出程度的难易及其原因,进一步深入了猪主动脉冻干的机理; 将冻干得到的血管进行复水实验,用Micro-CT扫描冻干血管整个复水过程的管壁及横截面变化图。图中明显看到复水的前0.5~1h管壁形状变化最大;孔隙率分析显示,复水时,孔隙率逐渐降低,直至接近新鲜血管;计算血管复水过程复水能力及复水速率的变化,结果表明,复水0.5~1h是血管急剧吸水变化的阶段,各项数据变化明显;1h~3h,水分的吸收呈线性增长;3h后,血管含水量、复水速率呈动态调整和变化,吸水基本达到饱和;对复水各阶段进行了详细的机理分析,解释了各项数据变化的原因,最终指出,常温条件下,生理盐水中浸泡2~2.5h的猪主动脉血管可进行移植应用; 对复水后的血管进行周向拉伸、轴向拉伸及穿刺方面的力学性能测试,探讨冻干后的血管移植入体内后,能否承受血液对其造成的各个方向的压力。宏观的力学测试结果与微观的新鲜及冻干复水的血管切片及染色组织学显微观察相结合,结果表明:周向拉伸时,长度变化的6mm范围内为弹性形变过程,轴向拉伸的弹性形变出现在2~2.5mm内,这与纤维的结构和本身特性有关;具体的周向拉伸、轴向拉伸及穿刺过程曲线都分别与新鲜血管该段过程曲线的趋势比较接近,说明血管在冻干后结构成分及排列方式没有发生大的改变;周向拉伸的血管应力-应变关系主要呈现两个阶段,弹性模量由小变大,而轴向拉伸则呈现出四个阶段,弹性模量先由小增大,再突然减小后增大,其中冻干复水的血管这种变化更加明显,这是由于纤维间孔隙的出现及弹性纤维的纵向排列造成的;拉伸长度方面,周向拉伸时,新鲜血管、冻干血管的最大伸长率分别为177%、311%,轴向拉伸时,新鲜血管、冻干血管的该项值分别为459%、300%;冻干后,周向拉伸应力、轴向拉伸应力、穿刺力分别较新鲜状态时减小了18.6%,增加了27.0%,增加了9.88%;结合显微观察结果,分析宏观力学变化的原因; 以上实验研究主要为如何得到高质量的移植血管提供理论基础。而临床的实际应用中,消除供体植入后的免疫排斥反应是移植过程的另一重要因素。 课题用脱细胞的方法将冻干后的血管脱细胞处理制成含细胞外基质(ECM)的支架材料。脱细胞时,利用冻干造成的孔隙,采取低浓度脱细胞试剂、较短的脱细胞时间分别处理冻干血管及新鲜血管,发现新鲜血管壁中间依然有细胞残留,而冻干的血管细胞已被去除殆尽,说明新鲜血管的脱细胞需要更高浓度的试剂长时间作用,势必导致组织结构及各种纤维的破坏,血管冻干后脱细胞在结构的完整、力学性能的维持方面较新鲜直接脱细胞有较大的优势。 为测定血管脱细胞的程度,组织学观察外,还进行透射电镜(TEM)及扫描电镜(SEM)深度的超微结构观察,未见细胞结构,且纤维排列有序,状态较为良好;MHC-Ⅰ及MHC-Ⅱ类抗原表达含量的测定结果,冻干脱细胞血管MHC-Ⅰ及MHC-Ⅱ类抗原的表达量显著降低,P 0.01;电泳测试,DNA分子的去除也十分明显。 分别手术移植冻干后未脱细胞的血管和脱细胞的血管支架于不同受体内以进行比较。术后3个月组织切片观察,冻干未脱细胞血管存在炎性反应及微血栓现象,严重影响血管的远期通畅率及宿主生命,冻干脱细胞的血管发现内膜的重新生成以及宿主细胞在内膜、中膜、外膜的浸润,除中膜的一部分未充分浸润外,其余各层结构都发现新细胞;心血管造影观察,冻干脱细胞血管通畅程度更高,未发现管径狭窄,未发现血管瘤,说明移植状态基本良好,冻干的血管段管径稍见狭窄及微小栓塞。 以上的理论研究结果及移植应用测试说明,冻干脱细胞血管支架用于临床移植是具有一定的可行性的。


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