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荧光定量PCR方法检测邻苯二甲酸酯的研究

白舟  
【摘要】:邻苯二甲酸酯(PAEs)是塑料的增塑剂,被广泛应用于塑料工业,普遍存在于土壤、底泥、水体、生物、空气及大气降尘物等环境样品中。关于邻苯二甲酸酯的检测有气相色谱法、液相色谱法、气相色谱-质谱法(GC-MS)、荧光法等。用色谱法检测不但昂贵费时,而且分析过程繁琐冗长。 近年来,随着生物技术的发展产生了许多邻苯二甲酸酯的生物检测方法。以核苷酸胶体染料-SYBR Green I为基础的荧光定量PCR是近年来出现的具有高灵敏度的定量PCR方法。 PAEs作为雌激素受体的配体,能够与雌激素受体结合并能诱导雌激素受体介导的基因表达。本文建立一种利用核酸外切酶保护-荧光定量PCR分析方法用于检测邻苯二甲酸酯。在传统酶切保护基础上,进一步利用S1核酸酶完全切除ExoⅢ酶切后留下的单链,使游离的DNA不能被扩增,并结合SYBR Green I荧光定量PCR技术进行检测。将建立的外切酶保护-荧光定量PCR方法应用于水样中PAEs含量的检测。并且,本实验还与GC-MS检测邻苯二甲酸脂的方法进行了比较。实验成果如下: 1.将购于市场的鲤鱼暴露于一定浓度的邻苯二甲酸脂中驯养一个月后,取其受体用于实验,通过电泳发现,经过邻苯二甲酸脂暴露过的荧光强度明显强于未暴露的一组鲤鱼。这证明了有外界环境激素邻苯二甲酸脂存在的情况下,可以刺激鲤鱼产生更多的受体。 2.采用SPR定性鉴定受体-配体复合效果,在加入邻苯二甲酸脂标准溶液浓度为109~1g/L范围内,邻苯二甲酸脂配体浓度与受体-配体复合物的SPR响应强度之间呈线性关系,表明受体与配体的复合度很好。 3.本实验分别进行了常规PCR与荧光定量PCR实验。得到了邻苯二甲酸脂浓度与Ct值的关系:Ct=-1.2361og(邻苯二甲酸脂的浓度)+12.375,R2=0.9956。分析结果表明,邻苯二甲酸脂浓度为10-8-10-2g/L时,线性关系显著。而当进一步降低邻苯二甲酸脂浓度时,检测结果为阴性,从而确定本实验中荧光定量PCR法对邻苯二甲酸脂的最低检测限为10-8g/L。 4.本实验还将荧光定量PCR方法与GC-MS方法进行了比较,得出用GC-MS方法进行检测时,检测限为10-5g/L。可以看出,本实验的新方法比GC-MS方法检测限低。 5.本实验还将荧光定量PCR检测邻苯二甲酸脂的方法应用到了环境样品的检测中,确定了环境样品中邻苯二甲酸脂的含量,结果表明,该方法准确、可行。 综上所述,本实验成功地建立了邻苯二甲酸脂的SYBR Green I荧光定量PCR监测方法,该方法检测限低,灵敏度高,准确性好,抗干扰性强,而且简单易行,可以将作为一种新的快速准确监测环境中痕量邻苯二甲酸脂的方法。


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