基于荧光定量技术的微囊藻毒素预测性监测方法研究

【摘要】：日趋严重的水体富营养化导致的水华现象已成为全球性的环境问题。水华形成的主要原因是由于水体中藻类的过度繁殖,其中的产毒蓝藻产生的蓝藻毒素蓄积在水中,严重威胁人们的饮水安全。蓝藻毒素是由七个氨基酸组成的环肽类物质,一般称为微囊藻毒素(Microcystins, MCYST)。微囊藻毒素通常以肝脏为靶器官,具有很强的致癌作用,人类和动物长期饮用含有微囊藻毒素的水可引起中毒及肝损伤,严重者甚至死亡。因此,加强对水体中藻毒素的监控和检测十分重要。 常用的微囊藻毒素检测方法有HPLC、LC-MS、GC-MS、 ELISA、PPIA、TLC等,这些方法各有优缺点,但其共同的不足之处在于均无法支撑微囊藻毒素预警性检测体系的建立。微囊藻毒素是伴随着微囊藻的生长繁殖而产生的,其在水体中必然会有释放与蓄积的规律。利用现代生物技术手段,结合分子生物学方法,利用藻类细胞生长过程中相关基因丰度变化与微囊藻毒素产生与积累之间的关联性,实现毒素的预警和预测对于保证饮水安全将是十分必要的。 微囊藻毒素合成酶基因簇由(mcy A-C)和(mcy D-J)两个相邻的但转录方向相反的大操纵子构成,分别编码聚酮合酶(polyketidesynthase, PKS)和非核糖体肽合成酶(non-ribosomalpeptide synthetase, NRPS),凡能产生微囊藻毒素的藻株均含有藻毒素合成酶基因簇。本课题对微囊藻毒素合成酶基因的检测方法进行了研究,为水华发生和微囊藻毒素的积累进行预警性监测提供了理论支撑。 首先,以微囊藻藻细胞为对象,建立全细胞PCR检测方法。以微囊藻毒素合成酶基因为靶基因,设计特异性引物,建立不受其它藻类细胞或杂菌等外界环境因子干扰的藻毒素合成酶基因全细胞PCR检测体系。方法具有操作简单快速,成本低,稳定性好,特异性强的特点。在20ul反应体系中,以5ul预处理的藻细胞为模板,检测下限可达103cells/ml,适用于低藻浓度水样中微囊藻产毒基因的检测。 其次,为了对微囊藻产毒基因进行定量,建立了针对微囊藻毒素合成酶基因的荧光定量PCR检测体系。以微囊藻毒素合成酶基因——mcy A、mcy B、mcy D、 mcy H及微囊藻特异性16S rDNA部分核苷酸保守序列为靶基因设计合成特异性引物,SYBR Green I为荧光染料,构建SYBR Green I荧光染料实时定量PCR微囊藻毒素检测体系。构建两个藻种株的人工体系,分别制备五个含产微囊藻毒素基因的重组质粒标准品,选取103-108ng/ul六个稀释度,每次反应均设置阴性对照和三个重复,以确保实验数据有效。结果表明：每个稀释度的Ct值稳定,标准差和变异系数较小,所获标准曲线初始模板拷贝数的对数值与Ct值之间线性关系良好,相关系数均在0.996以上,说明实验建立的标准曲线符合要求。 最后,将以上构建的微囊藻毒素实时荧光定量PCR体系法用于实验室培养的已知藻株及上海淀山湖水样的检测,并以高效液相色谱法(HPLC)进行验证对比,结果一致。研究结果初步说明,本课题建立的监测方法准确度高,灵敏度高,抗干扰性强。对于水样中产毒微囊藻的检测具有一定实用价值。