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环境中微量氯苯酚类环境激素的免疫分析方法研究

余宇燕  
【摘要】: 近几十年来,随着环境激素类人工合成化学品和药品使用的日益增多,对人和动物体的生理活性造成了很大的影响。环境激素是环境中的激素类似物,它能通过与激素受体结合,干扰生物体正常的生理代谢、内分泌和生殖机能,直接影响生物多样性,危及生物安全,对人类未来构成潜在威胁。环境激素污染问题已成为继臭氧层、地球气候变暖之后全球的第三大环境问题,成为环境科学研究领域中的热门课题。 本课题利用免疫分析方法具有快速灵敏、操作简便、经济适用等方面的特点,将其运用于环境中微量的环境激素的检测中,填补了传统色谱分析中的分析时间长、前处理繁琐及仪器昂贵的不足。当前,免疫分析技术应用于小分子物质的检测日益受到重视,已经成为监测分析环境中痕量污染物研究的热点,若将其与传统分析技术联用,相互借鉴相互补充,必然会有一个更为广阔的应用前景。 本课题为探讨有关环境激素的免疫化学特性,选择具有代表性的酚类环境激素中的三种氯苯酚:2,4-二氯苯酚(DCP)、2,4,6-三氯苯酚(TCP)和五氯苯酚(PCP)作为研究对象。将不具免疫原性小分子氯苯酚进行修饰改造合成半抗原,并与蛋白质偶联合成具有免疫原性的人工抗原,免疫动物产生抗体,根据抗原抗体的特异性结合反应,分别建立了三种氯苯酚类环境激素的免疫分析新方法,为环境激素的研究提供更加快速灵敏、简便经济的监测分析手段,为探索小分子化合物免疫分析技术的一些基本规律,研究和开发快速灵敏的痕量环境激素的检测新技术奠定基础。本课题主要研究内容如下: 1、对2,4-二氯苯酚、2,4,6-三氯苯酚和五氯苯酚结构进行修饰,通过重氮法在2,4-二氯苯酚分子中引入羧基基团合成了DCP半抗原;通过氯乙酸法在2,4,6-三氯苯酚和五氯苯酚分子中引入羧基基团分别合成了TCP和PCP半抗原。采用活化酯法或混合酸酐法使氯苯酚半抗原分别与牛血清白蛋白或卵清蛋白偶联,合成了氯苯酚-BSA免疫原和氯苯酚-OVA包被原。对各偶联物进行紫外光谱扫描和SDS-PAGE凝胶电泳鉴定,并计算出半抗原与蛋白质结合比在7-29:1之间,符合小分子免疫学的要求。 2、将免疫原与适当的佐剂乳化后,免疫新西兰大白兔制备了三种氯苯酚的多克隆抗体。以试管凝集试验、琼脂双向扩散实验和间接ELISA法鉴定了各个抗体的效价,其中,ELISA法测定抗DCP血清效价在3.2×10~4~1.28×10~5之间;抗TCP血清效价在1.6×10~4~1.28×10~5之间;抗PCP血清效价在6.4×10~4~1.28×10~5之间。用辛酸.硫酸铵二步沉淀法、葡聚糖凝胶除盐及DEAE-纤维柱精制提纯三种氯苯酚的抗血清,得到纯化的三种氯代苯酚抗体IgG,4℃或冻干于-20℃保存。 3、利用透析法制备的2,4-二氯苯酚的FITC荧光素标记抗体和抗DCP抗体,在优化条件下分别建立了2,4-二氯苯酚间接ELISA法、间接FIA法和直接FIA法。间接ELISA法的线性范围为2~100μg/L,线性方程为I=20.21logC+24.13,相关系数r=0.9917,检出限为0.63μg/L;间接FIA法的线性范围为1~100μg/L,线性方程为F=22.22logC+28.59,相关系数r=0.9898,检出限为0.41μg/L;直接FIA法的线性范围为1~100μg/L,线性方程为F=21.57logC+26.83,相关系数r=0.9926,检出限为0.48μg/L。其它氯苯酚类似物的交叉反应率均小于5%,由此说明所得的抗体对2,4-二氯苯酚有很强的特异性。比较可知,FIA法比ELISA法具有更宽的线性范围及更低的灵敏度。采用间接FIA法分别检测环境样品中2,4-二氯苯酚的含量,回收率在86.6~119.5%之间;变异系数CV在2.87~6.53%之间。采用直接FIA法分别检测环境样品中2,4-二氯苯酚的含量,回收率在84.6~114.7%之间;变异系数CV在1.73~7.46%之间。结果表明FIA法能满足环境样品中微量2,4-二氯苯酚的检测要求。 4、采用搅拌法制备了2,4,6-三氯苯酚的FITC荧光素标记抗体,琼脂双向扩散法鉴定标记抗体效价为1:16,间接FIA法鉴定标记抗体效价为6.4×10~4,抗体结合比率为3.4,符合实验要求。使用自制的FITC标记抗体和抗TCP抗体,在优化条件下分别建立了2,4,6-三氯苯酚直接FIA法和间接FIA法。直接FIA法的线性范围为1~100μg/L,线性方程为F=27.61logC+19.65,相关系数r=0.9938,检出限为1.02μg/L;间接FIA法的线性范围为0.5~100μg/L,线性方程为F=21.91logC+36.32,相关系数r=0.9936,检出限为0.18μg/L,除了对半抗原的交叉反应率较大外,其它氯苯酚类似物的交叉反应率均小于4%,由此说明所得的抗体对2,4,6-三氯苯酚有很强的特异性。采用直接FIA法分别检测环境样品中2,4,6-三氯苯酚的含量,回收率在84.5~110.8%之间;变异系数CV在2.05~7.94%之间。采用间接FIA法分别检测环境样品中2,4,6-三氯苯酚的含量,回收率在85~119%之间;变异系数CV在1.92~9.64%之间。结果表明FIA法能满足环境样品中微量2,4,6-三氯苯酚的检测要求。 5、利用制备的抗PCP抗体,在优化条件下建立了五氯苯酚间接FIA法。间接FIA法的线性范围为0.5~50μg/L,线性方程:F=4.15logC+33.03,相关系数r=0.9926,检出限为0.29μg/L,除了对半抗原的交叉反应率较大外,其它氯苯酚类似物的交叉反应率均小于6%,由此说明所得的抗体对五氯苯酚有很强的特异性。并在五氯苯酚间接FIA法的研究基础上,初步研制了一套五氯苯酚快速检验试剂盒,其内容包括:①包被好的荧光酶标板;②标准溶液;③抗体;④二抗;⑤洗涤液或稀释液。对试剂盒保存期的鉴定,可知试剂盒在-20℃、4℃可稳定保存数月,能够适用于大量样品的快速检测。将此试剂盒应用于检测土壤、纺织品和木材中微量五氯苯酚的残留,并与气相色谱法相比较,间接FIA法回收率在84.6~103.7%之间,变异系数CV在4.18~8.28%之间。结果表明FIA法能满足环境样品中微量五氯苯酚的检测的要求。


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