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酶法水解牛乳酪蛋白制备高F值寡肽混合物

孔芳  
【摘要】:在氨基酸混合物中,支链氨基酸(Branched chain amino acids,简称BCAA)与芳香族氨基酸(Aromatic amino acids,简称AAA)的摩尔比称为F值。高F值寡肽是蛋白酶作用食物蛋白后形成的一种低分子量的生理活性肽,它具有独特的氨基酸组成及肽链结构模式,能够减轻或消除肝性脑病症状、治疗苯丙酮尿症、改善手术后和卧床病人的蛋白质营养状况、降低血氨以及血清胆固醇的浓度、改善手术后和卧床病人的蛋白质营养状况、抑制癌细胞增殖等方面起着重要的生理功效。 目前,国内外已对高F值寡肽的制备进行了大量的研究,并对寡肽原料的选择以及提取工艺有了比较成熟的制备体系。近年来,以玉米蛋白粉、大豆蛋白等植物蛋白制备高F值寡肽的研究最为深入,而对动物蛋白的研究则较少。本研究以牛乳酪蛋白为原料,详细的研究了高F值寡肽的酶法制备过程和技术路线。这对于推动乳制品产业深层发展、进一步提高产品附加值、提高经济效益有重要的实践指导意义。 本研究主要内容包括Alcalase酶酶解酪蛋白的最佳条件,风味蛋白酶释放AAA的最佳条件,膜分离工艺,活性炭吸附去除酶解液中AAA的最佳条件以及酶解液的脱盐、去苦等工艺,并对酶解产物进行相对分子质量分布范围和F值的分析鉴定。主要研究结果如下: 1.L9(34)正交试验设计确定了Alacalase酶水解的最佳工艺条件是底物浓度2%、pH8.5、温度为55℃、加酶量为20μL。此时蛋白质的水解度可达30.56%。反应溶液的pH对酪蛋白的水解度影响最大,其次依次是底物浓度、温度、加酶量。 2.采用风味蛋白酶进行第二步水解,并且研究确定了酶水解的最适条件: pH6.5、加酶量为120μL、温度为50℃、时间3h。pH对风味蛋白酶酶解影响最大,其次依次是加酶量、时间、温度。并通过游离氨基酸的分析证实了风味蛋白酶的水解效果,水解液中游离的AAA有大幅度的提高。 3.通过二次酶解得到的混合肽中含有尚未水解的小分子蛋白、多肽、寡肽、游离氨基酸和大量盐离子。通过膜分离实验对蛋白质水解液进行纯化分离,分子量在5KDa以上的蛋白质和多肽被截留。经膜分离后得到的纯化浓缩液用活性炭吸附处理,以除去CAA.分别对5种不同颗粒大小的活性炭进行筛选,综合实验结果,1号活性炭(粉末状)的吸附效果最好,并进一步探讨了固液比(活性炭与寡肽液体积之比)、pH、温度、吸附时间对F值的影响,其结果表明当固液比1∶90、pH8.0、温度50℃、吸附时间1.5h时,所获得水解液的F值最高。 4.在水解过程中,为了维持酶解反应所需的最适pH,需要不断加入酸碱溶液,因此水解液中混入了大量的盐离子,需对寡肽溶液进行脱盐处理。本实验选择阴阳离子交换树脂脱盐,脱盐过程中,流速对蛋白质的回收率和脱盐率都有影响。样品的流速越大,脱盐率越低,蛋白质回收率越大。样品的流速越低,脱盐率越高但是蛋白质回收率降低。本实验选择6倍柱体积/小时,此时蛋白质的回收率达85.34%,脱盐率达到82.11%。 5.蛋白质在水解过程中会产生苦味,苦味的生成严重影响了蛋白质水解液的风味,因此需对水解液进行脱苦处理。考虑到要维持体系的氨基酸模式,本试验采用β一环状糊精包埋的方法控制苦味。β-环状糊精的加入,水解液的苦味逐渐减小,当添加量达到0.9%时,水解液的苦味值为0,因此选择β-环状糊精添加量为0.9%。 6.制得的高F值寡肽无色、无味、分子量1000。对所制备的寡肽溶液进行分析,紫外扫描结果表明活性炭对AAA吸附是很有效的,根据氨基酸自动分析仪得到的结果F值为21.06,符合高F值寡肽的标准。


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