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中国明对虾卵黄蛋白原mRNA在卵巢和肝胰腺中的表达量研究

程翔  
【摘要】:卵黄是对虾胚胎和无节幼体早期发育主要的营养来源。卵黄磷蛋白是所有卵生雌性动物卵黄的主要成分。十足目甲壳动物的卵黄磷蛋白(vitellin,Vn)是一种高分子量的脂-糖-类胡萝卜素蛋白。卵黄磷蛋白是由其前体-卵黄蛋白原(vitellogenin,Vg)释放到血淋巴中被卵母细胞吸收后加工(主要是糖基化)形成。卵黄蛋白原合成部位因种类不同而不同。甲壳动物的卵巢,脂肪组织和肝胰腺都可能是合成卵黄蛋白原的部位,而大多数的昆虫则主要靠脂肪体合成。近年来在对中国明对虾的研究表明:卵巢和肝胰腺都是卵黄蛋白原的合成部位,但是对中国明对虾这两种组织在不同卵巢发育阶段卵黄蛋白原合成的定量研究还很少。本实验采用敏感性和特异性都很高的实时荧光定量PCR的研究方法,测定了雌性中国明对虾在卵巢发育的5个不同时期,卵巢和肝胰腺卵黄蛋白原mRNA的相对表达水平。定量分析了卵巢和肝胰腺两组织在卵巢发育过程中卵黄蛋白原mRNA的表达差异。本研究结果对阐明中国明对虾的卵黄蛋白原来源及合成过程具有重要意义,进而为人工繁殖的生产实践提供基础的理论依据。 通过对中国明对虾解剖观察,将卵巢分为前叶,中叶,侧叶,后叶前部和后叶后部共5个部位。分别用固定液固定然后石蜡切片,苏木精伊红染色封片后显微镜观察。根据卵巢的颜色,性腺指数,以及卵细胞直径,核径等特征进行卵巢发育分期。结果可知:卵巢发育可分为5个时期:卵原细胞增殖期、卵黄发生前期、初级卵黄发生期、次级卵黄发生期和消退期。绝大多数采样虾卵巢的5个不同部位的卵细胞特征类似,处于同一个卵巢发育时期,少数卵巢的后叶后部发育慢于其他四个部位一个时期。说明中国明对虾卵巢头胸部部分有先于腹部部分(腹叶)成熟的发育不同步现象。 中国明对虾的卵巢发育分期后,采用实时荧光定量PCR的相对定量方法测定了卵巢和肝胰腺中卵黄蛋白原mRNA在5个卵巢发育时期的相对表达水平。提取5个时期卵巢和肝胰腺两个组织的总RNA,设计目的基因卵黄蛋白原mRNA和内标基因18S ribosomal RNA的特异性的引物,优化荧光定量PCR的扩增体系和反应条件后进行扩增,然后对卵黄蛋白原mRNA表达进行相对定量分析。结果表明:在卵巢发育的5个阶段,卵巢和肝胰腺中都有卵黄蛋白原mRNA表达,更进一步证明卵巢和肝胰腺都是卵黄蛋白原的合成位点。在卵巢中,从卵原细胞增殖期到初级卵黄发生期,卵黄蛋白原mRNA随着卵巢发育表达量呈上升趋势,原始表达量分别为:0.04、0.23和1.03,而在次级卵黄发生期卵黄蛋白原mRNA的表达量急剧减少到0.16,消退期的表达量又显著增加到1.00。初级卵黄发生期和消退期的卵黄蛋白原mRNA表达量相对较高,次级卵黄发生期和卵黄发生前期表达量比较低。在肝胰腺中,从卵原细胞增殖期到次级卵黄发生期,随着卵巢的发育卵黄蛋白原mRNA表达量呈上升趋势,原始表达量分别为:0.01、0.07、0.19和1.29。消退期的卵黄蛋白原mRNA表达量减少到0.74。次级卵黄发生期的卵黄蛋白原mRNA表达量最高,消退期次之,卵原细胞增殖期和卵黄发生前期卵黄蛋白原mRNA表达量很低。 卵巢和肝胰腺的表达量比较可知,除了次级卵黄发生期,其他4个时期,卵巢中的卵黄蛋白原mRNA表达量都比肝胰腺多。卵原细胞增殖期,卵黄发生前期,初级卵黄发生期,消退期卵巢中的卵黄蛋白原mRNA表达量分别是肝胰腺的4倍,3.2倍,5.4倍和1.3倍;而在次级卵黄发生期,肝胰腺中的表达量明显比卵巢高,前者是后者的8.2倍。在两种组织相互互补的作用下,从初级卵黄发生期到消退期,卵巢和肝胰腺中的卵黄蛋白原mRNA表达量总体都保持在较高水平。


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