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刺参(Apostichopus japonicus)微卫星标记的筛选及群体分析

孙孝德  
【摘要】:利用微卫星DNA技术对刺参微卫星标记进行筛选及其群体分析。首先,对刺参不同部位的DNA提取效果进行研究,分别以CTAB法、SDS法、Segama试剂盒法对刺参的触手、管足、体壁、纵肌、肠和呼吸树组织进行基因组DNA的提取,均得到了高质量的基因组DNA。Segama试剂盒提取DNA条带较其他两种方法清晰,杂质少且无降解,效果最佳;对比六种不同的刺参组织,其中纵肌组织三种方法均获得高质量基因组DNA,为提取基因组DNA的首选组织;同时利用刺参触手和管足活体取样提取基因组DNA的方法,也得到了高质量理想的基因组DNA,这为刺参的无损伤取样提供了有力的实际方面的支持,这样既可以保证将来刺参家系建立过程中亲体的健康存活又可以减少试验样品由于取样所带来的机体损伤。 通过FIASCO技术对刺参微卫星标记进行筛选,共得到58条含有微卫星的序列,其中6条为相同序列,结果表明3条序列含有两个以上微卫星微点,52条序列含有重复数大于5的重复微卫星序列,2序列还有四碱基重复4次以上,可以进行引物开发;5条序列的重复次数在5次以下或微卫星DNA序列出现中断,不适合设计引物。综合分析得56个微卫星核心序列,52条微卫星序列已提交NCBI数据库。在得到的56个微卫星核心序列中,完美的微卫星DNA共30个,占53%;不完美的微卫星DNA共14个,占25%;复合的微卫星DNA有12个,占21%。在所获得的微卫星DNA序列中核心序列重复5-9次的有43个,占76%;重复10-19次的有7个,占12.5%;重复20-29次的有2个,占3.5%;重复30次以上的有4条序列,占7.1%,在所获得的微卫星DNA序列中重复次数在1~9之间的最多。 对现在已发布的刺参6632条ESTs的数据库中的2-6个碱基重复单元的微卫星序列利用微卫星查找软件进行分析,并且进一步比较分析这些微卫星序列的丰度和分布。双碱基重复序列146个,占ESTs数据库中发现微卫星序列总数的65.86%,数量最多;三、四、五、六碱基重复序列分别占微卫星序列总数的26.68%、1.68%、0.24%、5.53%;双碱基、;三、四、五、六碱基重复序列一共416个,占整个ESTs数据库的6.48%。利用Primer软件结合人工方法对含有SSR位点的EST序列设计合成引物21对,其中13对引物表现良好,并且多态位点丰富。扩增产物变性聚丙烯酰胺胶电泳,统计每个微卫星标记等位基因数目,计算等位基因频率、观测杂合度、期望杂合度等统计学指标的评价。结果表明,在13个微卫星位点上,等位基因的数目从3到8不等,等位基因长度从175~382bp,观测杂合度和期望杂合度分别为0.158-0.650和0.198-0.841,所筛选微卫星标记可于遗传分析。 利用微卫星DNA技术对野生刺参和两代选育刺参群体遗传多样性进行了研究。9对微卫星引物在三个刺参群体中共扩增获得43个等位基因,每个微卫星位点所检测到的等位基因数为2-7个。三个实验群体的观测杂合度的平均值分别为0.6556、0.6704和0.6148,多态信息含量平均值分别为0.6654、0.5929和0.5275。Hardy-Weinberg平衡及F-检验数据显示人工累代选育已经使群体的遗传结构发生了变化,表现为3个群体在某些位点都出现了杂合子缺失现象,偏离平衡的位点逐代增加,相邻世代之间遗传分化系数逐代减小。FST平均值0.0443提示出选育群体处在较弱的分化水平,说明遗传变异主要来自于群体内个体间。


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