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三疣梭子蟹Na~+,K~+-ATPase盐度调控机制的初步研究

江山  
【摘要】:三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus),甲壳纲(Crustacea),十足目(Decapoda),梭子蟹科(Portunidae),梭子蟹属(Portunus)。是我国最重要的海洋养殖品种之一,具有重大经济意义。在胚胎发育乃至整个幼体阶段中,三疣梭子蟹对环境盐度的变化非常敏感,稍有不慎即会引起变态推迟、活力变差等现象发生。盐度过高容易导致其蚤状幼体较难变为大眼幼体以及大眼幼体变态率降低。因此,在三疣梭子蟹人工养殖过程中,水体盐度是一个很重要的因素。弄清楚三疣梭子蟹对环境盐度的适应机制在理论和生产上均具有重要的意义。 本项目通过研究不同盐度胁迫和不同胁迫时间下三疣梭子蟹各组织中Na~+,K~+-ATPase mRNA的表达水平变化,Na~+,K~+-ATPas酶活性变化以及形态学和免疫组织化学特性,从基因水平、蛋白质水平和组织水平三个层面探究三疣梭子蟹鳃Na~+,K~+-ATPase在渗透调节机制中的可能存在的功能。 利用半定量RT-PCR技术,检测了Na~+,K~+-ATPase mRNA的表达,发现与对照盐度环境(25)相比,在高盐(40)与低盐胁迫(10)环境胁迫时,三疣梭子蟹第6对鳃的Na~+,K~+-ATPase mRNA的表达水平均出现不同程度的增加;而肠和肌肉组织中,该基因的表达变化不明显。可以推测:当三疣梭子蟹受到盐度胁迫时,Na~+,K~+-ATPase mRNA能迅速做出反应,以适应外界环境的变化。 Na~+,K~+-ATPase最基本的功能是催化ATP水解,释放出无机磷(Pi)。在Mg2+与ATP足量的情况下,酶的活性与释放的Pi量成正比,通过测定反应释放的Pi量即可获得酶活性的高低。根据以上原理,进行三疣梭子蟹盐度胁迫下酶活性测定实验发现,无论在高盐度和低盐度胁迫下,鳃中Na~+,K~+-ATPase酶活性均呈现类似的趋势,即鳃中的Na~+,K~+-ATPase酶活性随胁迫时间的增加呈现出先下降,再上升,后下降并趋于平稳的趋势。另外,本实验还发现三疣梭子蟹后3对鳃Na~+,K~+-ATPase的酶活性显著高于前5对鳃的酶活性。三疣梭子蟹各对鳃Na~+,K~+-ATPase的酶活性差异揭示:三疣梭子蟹进行离子转运和渗透调节的主要部位是其后3对鳃。 利用免疫组织化学技术对鳃组织中Na~+,K~+-ATPase蛋白表达进行组织学定位。对高盐和低盐条件胁迫1d下鳃组织的石蜡切片的免疫组织化学结果表明:三疣梭子蟹在高盐度胁迫1d时,Na~+,K~+-ATPase蛋白表达水平明显增加,而低盐胁迫1d时,Na~+,K~+-ATPase蛋白表达量并没有明显改变。由此可推断,Na~+,K~+-ATPase酶对高盐胁迫更加敏感。 盐度胁迫1d的鳃组织样本经过H.E.染色,以25盐度的切片样本作为对照观察实验结果。结果表明:高盐度(40ppt)胁迫下的氯细胞数量明显增加;在低盐胁迫1d时,氯细胞则主要集中分布在鳃丝基部,细胞游离面向内凹陷。这暗示:Na~+,K~+-ATPase酶对高盐胁迫更加敏感。 综合来看,本项研究揭示:无论在高盐或低盐环境盐度胁迫下,三疣梭子蟹Na~+,K~+-ATPase mRNA水平呈现明显的增加;而仅在高盐胁迫初期,Na~+,K~+-ATPase蛋白表达水平明显增加;而低盐胁迫初期,Na~+,K~+-ATPase蛋白表达量并没有明显改变;Na~+,K~+-ATPase酶对高盐胁迫更加敏感。另外,本项研究还揭示:高盐和低盐胁迫下,三疣梭子蟹Na~+,K~+-ATPase酶活的调节可能分为:被动应激期、主动调节期和适应期。三疣梭子蟹Na~+,K~+-ATPase参与了渗透调节过程。


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