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组织胺对新糠虾和中华绒螯蟹的消化功能、免疫力以及卵巢发育的影响

赵柳兰  
【摘要】:中华绒螯蟹在养殖的过程中,鱼粉和冰鲜野杂鱼常常被作为饲料原料或直接投喂,由于在鱼粉的制备工艺或者野杂鱼的运输、储存不当等原因,往往会导致饲料或者野杂鱼的变质、腐败,产生大量的生物胺。而组织胺作为毒性(scombroidpoisoning)最大的一种生物胺,常被作为检测鱼粉质量以及野杂鱼的新鲜度的一个标准,也是食品安全的重要检测指标。目前已经有研究发现摄食组织胺饲料能够影响甲壳动物的生长,存活以及性成熟,而消化、免疫以及性腺的发育是维持其正常的生长所必须的基础。目前已有研究证实,组织胺能够引起鱼以及家禽胃肠道疾病,而有关组织胺对甲壳动物消化功能的影响未见报道。日本和黑褐新糠虾常常作为毒性监测的良好模式生物,而中华绒螯蟹存在生长周期长以及采样的局限性,所以本文通过研究组织胺对日本新糠虾消化、免疫以及卵巢发育影响进行方法的探索,继而为组织胺影响中华绒螯蟹的这些生理功能提供具体依据,也是首次探索组织胺影响甲壳动物消化、免疫以及卵巢发育的机理,也为冰鲜野杂鱼的投喂提供科学的指导。 (1)消化道和肝胰腺是甲壳动物主要的消化器官,消化组织结构的完整以及消化酶的正常分泌是维持消化功能的关键。通过投喂新糠虾和中华绒螯蟹不同浓度的组织胺饲料(1000,2000和4000mg/kg组织胺)17d和28d,对消化道和肝胰腺组织结构的组织学分析以及消化酶测定,结果表明: a.1000mg/kg组织胺均能够导致新糠虾和中华绒螯蟹肝胰腺上皮细胞严重的脱落、破损甚至基膜分离;4000mg/kg能够引起其B-cell显著增多以及管壁变薄,并且2000mg/kg组织胺能够引起中华绒螯蟹肝胰腺F-cell和内腔上皮细胞凸起的增多; b.而对消化道的组织切片发现,组织胺能够导致新糠虾中肠上皮细胞排列稀疏,破损甚至脱落,其中1000mg/kg浓度组尤为显著;而4000mg/kg的组织胺能够引起后肠的管壁变薄以及膜分离;对中华绒螯蟹的中肠以及后肠未见类似影响,但是能够引起其肠球中部嗜碱性细胞以及相连的网状组织中的嗜伊红细胞的变化,其中1000mg/kg能够减少其肠球中嗜碱性细胞和网状组织中嗜伊红细胞,而2000和4000mg/kg的组织胺能分别增加其网状组织中的嗜伊红细胞和肠球中的嗜碱性细胞,组织胺对其后肠结缔组织中嗜伊红细胞以及嵴也有影响,1000mg/kg的嗜伊红细胞密度与对照组未见差异,但是能够引起皱襞粘膜层中的嗜伊红物质的增加,而2000和4000mg/kg组的嗜伊红密度降低。 c.对肠球以及后肠的细胞增殖的免疫组化发现,组织胺能够引起肠球以及后肠嵴中细胞增殖阳性,其肠球中的阳性细胞的变化的规律与嗜碱性细胞规律一致,而嵴中的阳性则与其嗜伊红物质一致。而肥大细胞是组织胺释放的主要细胞,通过肥大细胞特异性染色(甲苯胺蓝以及阿尔新蓝-番红染色法)发现,其肠球中的嗜碱性细胞以及后肠结缔组织中的嗜伊红细胞均呈现甲苯胺蓝以及阿尔新蓝-番红着染,并且肠球以及网状组织中的颗粒呈现组织胺免疫阳性,因此肠球以及后肠中存在类肥大细胞的物质,可能通过组织胺的释放影响肠道的组织结构。 (2)类胰蛋白酶,淀粉酶以及脂肪酶是甲壳动物主要的消化酶。通过饲喂以上浓度组织胺饲料28d,结果表明: a.组织胺能够影响肝胰腺和消化道的消化酶活性,并且肝胰腺中的影响较为显著,即肝胰腺1000mg/kg组的类胰蛋白酶和脂肪酶在7,14,21和28d均显著低于对照组(p0.05),而淀粉酶在7d和14d显著低于对照组(p0.05);消化道1000mg/kg组类胰蛋白酶,淀粉酶以及脂肪酶仅分别在7d,7d~21d以及28d显著低于对照组(p0.05)。 b.而肝胰腺中三种消化酶的影响中,类胰蛋白酶的影响较大。在第7d时,组织胺处理后的肝胰腺的类胰蛋白酶的活性均较对照组(1.76±0.02)U/(mg.prot)有显著降低(p0.05),分别为对照组的27.00%(1000mg/kg)、71.79%(2000mg/kg)、57.75%(4000mg/kg),其中1000mg/kg组织胺投喂组,其酶活力较其他两个组织胺组更为显著,各组织胺组之间的酶活均存在显著性差异(p0.05)。14~28d,除了4000mg/kg酶活性与对照组之间无显著,其类胰蛋白酶也均显著低于对照组。而淀粉酶在7d和14d时,组织胺处理后的酶活均低于对照组,并且具有显著性差异(p0.05);21d和28d时,其淀粉酶活性与对照组不存在显著性差异(p0.05)。脂肪酶在7d的时候,组织胺组的脂肪酶活性均显著低于对照组(p0.05),但是各浓度组之间没有显著性差异,14~28d时,仅低浓度组(1000mg/kg)与对照组有显著性差异(p0.05)。 c.并且对肝胰腺类胰蛋白酶进行RT-PCR测定发现其组织胺对类胰蛋白酶的影响与其mRNA基本一致。 (3)通过饲喂以及注射两种方式对组织胺在中华绒螯蟹肝胰腺,肌肉中的累积发现,注射组织胺浓度为0,1,50,100和200g/g在96h内能够在肝胰腺和肌肉中出现累积,并且肝胰腺和肌肉中组织胺浓度与注射的浓度呈正比,而饲喂含0,1000,2000和4000mg/kg组织胺饲料28d。发现肌肉中检测不到组织胺,而肝胰腺中仅7d组织胺饲喂组组织胺含量均显著高于对照组。对28d肌肉,肝胰腺以及血清组织胺主要的代谢酶二胺氧化酶(DAO)的酶活性测定发现,肌肉中DAO的酶活显著高于肝胰腺,这可能是肌肉中检测不到组织胺的原因。说明组织胺能够在短期内在体内累积,并且短期内组织胺能够增加体内章鱼胺和5-HT的含量,对腐胺则影响无规律。 因此,组织胺能够导致肝胰腺细胞(B-和F-细胞)比例发生变化以及消化道(中肠以及后肠等)组织结构的产生损伤,细胞增殖,并且消化酶活性降低,其中1000mg/kg组织胺浓度组影响尤为显著,组织胺从转录水平影响肝胰腺中类胰蛋白酶的活性。而组织胺能够在短期内在体内累积,并且短期内组织胺能够增加体内章鱼胺和5-HT的含量,对腐胺则影响无规律。 (4)通过对日本新糠虾和黑褐新糠虾对溶藻弧菌的敏感性以及血细胞形态和组成的比较,发现日本新糠虾敏感性较高即96h的累积,而颗粒细胞比例要低于黑褐新糠虾,但是其形态更多样。因而对日本新糠虾的血细胞形态进行光镜和电镜的观察发现,其血细胞由三种类型的细胞组成,即透明细胞,半颗粒细胞和颗粒细胞组成,细胞大小依次升高,以颗粒细胞所占比例最多,约占细胞总数的一半,约为48%,其次为半颗粒细胞,其比例约为31%。比例最小的是透明细胞,仅约为21%,三组间均有显著性差异(p0.05),电镜发现其颗粒细胞胞质中有大量的颗粒物质。 组织胺水体(0,10,20和40mg/L)浸泡日本新糠虾30d后,其血细胞中颗粒细胞的比例显著下降,而胞质中的颗粒物质明显减少,并且40mg/L组织胺浓度组的颗粒细胞形态更加多样性。组织胺处理之后,对其组织的免疫酶进行测定,结果发现溶菌酶和酚氧化酶活性随组织浓度上升而显著下降(p0.05)而ACP和AKP的活性无显著影响(p0.05)。 注射中华绒螯蟹的浓度为0,1,50和100g/g组织胺,1h后注射7.2×108cfu/ml,在12、24、36、48、72和96h的观察其抵御嗜水气单胞菌的死亡率,结果表明96h其组织胺浓度组的死亡率均显著高于对照组(p0.05),但是单独的注射组织胺不会导致中华绒螯蟹死亡,却能够引起酚氧化酶(PO)和超氧化物歧化酶(SOD)活性升高(p0.05),24h总的血细胞数目(THC)与对照组无显著差异而磷酸酶(ACP和AKP)则无规律变化。注射组织胺后,中华绒螯蟹产生明显的自切和颤抖现象,并且自切率随着组织胺浓度的上升而上升(p0.05)。 总之,组织胺能够影响免疫酶以及血细胞的形态和组成,提高对嗜水气单胞菌的敏感性,产生自切现象,并且存在种间的差异性。 (5)对不同卵巢发育期的日本新糠虾雌激素受体的免疫组化发现,卵巢发育早期其卵母细胞的雌激素受体强烈阳性,因此选取一期的中华绒螯蟹研究组织胺对其卵巢发育的影响。通过中华绒螯蟹注射组织胺的浓度为0,1,50,100和200g/g后,96h取其卵巢,进行组织学的研究发现,组织胺能够影响中华绒螯蟹一期卵巢的卵细胞排列以及形态,并且存在浓度的差异性。其中50g/g能够显著的导致卵母细胞间隙变大,中部排列稀疏,细胞变形严重,有的退化成空的滤泡腔;100g/g与50g/g浓度的影响类似,而200g/g则边缘形成较多的小细胞。通过细胞增殖染色发现这些变形的卵细胞以及形成的小细胞均显示强烈的阳性,而雌激素受体的染色发现中部的这些变形的细胞则显示弱阳性,小颗粒细胞仍然显示雌激素受体强烈阳性。


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