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“全红”体色瓯江彩鲤MHC多态性及其与鱼体抗病力关系的分析

李雪松  
【摘要】:主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility Complex, MHC)是存在于脊椎动物体内与免疫功能密切相关的高度多态的基因群。许多研究表明,MHC不同等位基因与机体的抗病力密切相关。本研究以分布于我国浙江省瓯江流域的地方性鲤科鱼类——瓯江彩鲤(Cyprinus carpio var. color)为对象,通过人工感染嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)后,分析“全红”体色瓯江彩鲤MHC基因家族中MHC I α、MHC II α和MHC II β等位基因的多态性及其与鱼体抗病力之间的关系。研究结果将为瓯江彩鲤抗病相关基因的筛选及抗病育种奠定基础。 主要结果如下: 1、“全红”体色瓯江彩鲤MHC-DAB基因多态性及其与鱼体抗病力关系的分析 利用一对特异性引物DABF和DABR,分别从21尾感病和16尾抗病“全红”体色瓯江彩鲤的cDNA中,扩增出长度为624bp的MHC-DAB基因片段。共测序185个有效克隆,获得76个不同的核苷酸序列。MHC-DAB基因片段包括第1~4外显子,分别编码信号肽、β1和β2结构域及跨膜区。长度为276bp的β1结构域有144个核苷酸变异位点(52.17%)和70个氨基酸变异位点(76.07%),而长度为282bp的β2结构域只有98个核苷酸变异位点(34.75%)和50个氨基酸变异位点(53.19%),显示β1结构域的变异要明显大于β2结构域。在β1结构域的24个抗原结合位点(PBR)上,有23个发生了变异。β1结构域的PBR、非抗原结合位点(non-PBR)及β2结构域的ω值(ω=dN/dS)分别为1.367、0.886和0.754,表明“全红”体色瓯江彩鲤MHC-DAB基因(特别是β1结构域)在进化过程中受到正向选择作用。在所得的20个不同的等位基因中,基因DAB3*15在抗病群体中出现的频率(13.75%)显著高于感病群体中出现的频率(3.81%)(P0.05);基因DAB3*09和DAB3*10的出现频率都为3.75%(P0.05),仅存在于抗病群体中;而基因DAB3*02和DAB3*14的出现频率分别为7.62%(P0.05)和8.57%(P0.01),仅存在于感病群体中。 2、“全红”体色瓯江彩鲤MHC II α基因多态性及其与鱼体抗病力关系的分析 根据已知鲤(Cyprinus carpio)的主要组织相容性复合体MHC II α基因序列设计特异性引物,分别从21尾感病和16尾抗病“全红”体色瓯江彩鲤cDNA中扩增了包括MHC II α基因完整外显子2和外显子3在内的长度为624bp的基因片段。共测序180个有效克隆,获得85条不同的核苷酸序列,分属10个不同的等位基因。MHC II α基因片段包括第1~4外显子,分别编码信号肽、α1和α2结构域及跨膜区。α1结构域的变异要明显大于α2结构域,表现在:长度为252bp的α1结构域有105个核苷酸变异位点(41.67%)和49个氨基酸变异位点(58.33%),而长度为285bp的α2结构域的核苷酸、氨基酸变异位点却较少,分别为84个(29.47%)和43个(45.26%)。在α1结构域的21个抗原结合位点(PBR)上,有15个发生了变异。α1结构域的PBR、非抗原结合位点(non-PBR)及α2结构域的ω值(ω=dN/dS)分别为3.982、0.725和0.500,表明“全红”体色瓯江彩鲤MHC II α基因(特别是α1结构域)在进化过程中受到正向选择作用。在所得的10个不同的等位基因中,基因Cyca-DXA7只出现在抗病群体中,频率为9.09%,达到了极显著水平(P0.01)。 3、“全红”体色瓯江彩鲤MHC I类基因的克隆与多态性分析 为了解“全红”体色瓯江彩鲤MHC I类基因的多态性,本研究从30尾样本的cDNA中,克隆出18尾鱼的MHC I类基因,成功测序75个克隆并获得长度为972bp~993bp的核苷酸序列71条。这些序列编码324~331个氨基酸,包括完整的信号肽、α1、α2、α3结构域、连接肽、跨膜区及部分胞质区。71条核苷酸序列编码49条不同的氨基酸序列,可归为11个等位基因;总的核苷酸、氨基酸变异位点比例分别为45.68%和60.84%,而核苷酸/氨基酸序列间的变异范围分别为0%~57.7%和0%~75.9%,都表明“全红”体色解瓯江彩鲤MHC I类基因的多态性很丰富。分析表明,α1、α2结构域的核苷酸/氨基酸变异位点比例分别为65.90%/79.31%、56.38%/72.34%,都明显高于α3结构域的30.24%和46.39%。α1和α2结构域抗原结合区(PBR)的非同义替换率/同义替换率的比值ω(1.219和1.639)都大于1,且这两个结构域中检测到的7~12个受正向选择的氨基酸位点,除位点23A和130F外,都位于PBR区,从而揭示正向选择作用是维持“全红”体色瓯江彩鲤MHC I类基因多态性的机制之一。


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