太湖养殖中华绒螯蟹肠道菌群多样性研究

【摘要】：中华绒螯蟹是东南亚非常重要的经济水产品，目前在中国被广泛养殖。中华绒螯蟹肠道菌群结构将成为提高免疫力，抵抗疾病，增强营养，增加产量的一个新途径。但目前为止，对其肠道细菌多样性知之甚少。为了更进一步地了解其肠道微生物多样性进而发掘其潜在益生菌，本研究综合运用了很多种方法，包括定量PCR、荧光染色计数、16S rDNA克隆测序（依赖纯培养和不依赖纯培养）、荧光原位杂交以及电子显微镜观察。 定量PCR结果发现中华绒螯蟹肠道内细菌数量为（1.8±0.8)×10~7/μl。荧光染色计数结果为(2.5±0.9)×10~6/μl。方法差异导致的结果偏差是合理的。比较已发表的中华绒螯蟹肠道内菌群数量，两次研究结果相差不大，说明成蟹肠道内菌群数量处于稳定水平，不会随着养殖环境、养殖季节等产生太大的波动。 不依赖纯培养的克隆测序结果发现，中华绒螯蟹肠道内菌群大多分为三类，变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和厚壁菌门（Firmicutes），其所占数量比例依次为35.5%、32.6%、31.2%。这些数据说明，这三个门可能是中华绒螯蟹肠道细菌的主要组成。变形菌门包含49个克隆，可进一步分属到4个纲，α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）7个,β-变形菌纲（Betaproteobacteria）2个，γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）14个，ε-变形菌纲（Epsilonproteobacteria）26个，很明显后两个纲为优势类群。属水平上，138个克隆被分为14个类群，包括5个未知类群和9个有明确分类地位的类群。其中最优势菌属为弓形杆菌属（Arcobacter）、unclassified（Sphingobacteria）、Marinifilum和unclassified（Firmicutes）。此外，7个克隆分属厚壁菌门，与NCBI中的已有序列相似性仅为91%，1个克隆被鉴定为TM7，这是一类还未曾找到一株分离菌的待定类群，其序列相似性也仅为91%。很有可能，这两个类群代表存在于中华绒螯蟹肠道内的新群体。 比较已发表的中华绒螯蟹肠道优势菌群结果，拟杆菌门中的unclassified（Sphingobacteria）和Marinifilum是蟹肠道内的长居菌群，占有相当的数量优势。这些都符合潜在益生菌的筛选标准。同时，Marinifilum为丝状菌，系统发育分析，其亲缘关系最近的是食骨蠕虫的内共生体，更加增加了其成为益生菌的可能性。另外一类不可培养细菌，系统发育分析属于鞘脂杆菌纲，其功能未知。除此以外，作为最优势菌属之一的弓形杆菌也可能是益生菌。 依赖纯培养的克隆测序结果发现，62株菌分为11个系统发育型（phylotype）。除了Chryseobacterium外，其余的类群都属于γ-变形菌纲。其中优势菌属为弧菌属（Vibrio）和希瓦氏菌属（Shewanella），并没有分离到弓形杆菌属，说明它可能不是中华绒螯蟹肠道内的长居菌群。 荧光原位杂交结果表明，中华绒螯蟹肠道内没有ε-变形菌门的菌，更没有弓形杆菌，这与依赖纯培养的克隆测序结果。再次证明了弓形杆菌不是中华绒螯蟹肠道内的稳定优势菌群，不能成为潜在益生菌的筛选对象。但是蟹肠道内稳定存在拟杆菌门的细菌，而且占有相当的数量优势，这与克隆文库的结果，包括已发表的蟹肠道菌群的结果是一致的。 电子显微镜观察到，在中肠有很多丝状菌和球菌，丝状菌直接插在微绒毛中间，而球菌则通过形成柄基结构插在微绒毛中间；在后肠有很多杆菌，周身长满了菌毛状结构，紧紧靶定在肠上皮细胞表面。这些特殊结构正是它们成为长居优势菌群的有力支撑，与不依赖纯培养的克隆文库的结果相辅相成。 这些结果说明unclassified（Sphingobacteria）和Marinifilum很可能是中华绒螯蟹肠道内潜在的益生菌。但是在它们成为真正的益生菌运用到养殖前还有非常多的工作需要完成，它们与中华绒螯蟹的相互作用还需要更多的实验做进一步的研究。