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三疣梭子蟹CYP4C和EcR基因的cDNA克隆与表达分析

张晓燕  
【摘要】:甲壳动物的生长发育伴随着周期性的蜕皮活动,是机体蜕去旧的外骨骼长出新的外骨骼的过程,蜕皮作为甲壳动物生长、发育过程中的一个标志性特征,研究报道表明,其主要由头胸部前端Y器所分泌类固醇的蜕皮激素所控制,但是,整个蜕皮过程是一个复杂的生理过程,涉及了一系列酶、激素以及调控因子等的参与,受到内分泌系统和神经系统的共同调节。细胞色素CYP4C是体内重要的代谢酶类,在海洋甲壳类上的研究主要涉及到多环芳烃类、海洋污染物等外源物质对其的诱导作用及其代谢,以及参与蜕皮激素等内源物质的合成代谢等功能的研究;蜕皮激素受体EcR是蜕皮激素的作用靶标,处于甲壳动物蜕皮过程的级联反应启动关键位置,在转录水平上传递20E信号,是参与蜕皮调控作用的重要因子之一。目前在甲壳动物上对CYP4和EcR的研究比较少,尤其是两者与蜕皮之间关系的研究更为少见,环境因子的急剧变化对其产生影响方面的研究,目前亦尚未见报道。 本研究通过克隆获得三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)细胞色素CYP4C、EcR基因全长序列,并对其在急性盐度胁迫下组织表达特征进行了初步研究,以期为三疣梭子蟹CYP4C、EcR与环境盐度适应的相关性研究及其在盐度适应过程中生理功能的研究提供依据。此外,本实验还探讨了EcR在胚胎发育过程中的表达情况,为从分子水平研究蜕皮类调节因子在胚胎发育过程中所起的作用,也为进一步阐明甲壳动物的蜕皮机制,解决性早熟及蜕皮未遂等生产实际问题提供重要的理论依据。 本研究共分为三部分: 第一部分是以三疣梭子蟹为研究对象,通过简并引物扩增及SMARTTMRACE技术获得了细胞色素CYP4C基因的cDNA全长序列。三疣梭子蟹CYP4C基因全长1890bp,编码一个由514个氨基酸组成的多肽,预测分子量大小为59.54kDa,理论等电点为8.08。氨基酸序列中含有CYP基因家族特有的K螺旋保守序列(ExxR)和血红素结合区(FxxGxxxCxG)。同源性及系统进化分析表明,三疣梭子蟹CYP4C基因与岸蟹、凡纳滨对虾、日本沼虾、中国对虾、沟虾、红螯螯虾的同源性分别为88%、72%、66%、59%、60%、59%。荧光定量RT-PCR结果表明,CYP4C在肝胰腺、肌肉、眼柄、鳃和心脏中均有分布,在肝胰腺中表达量最高。高盐(45)胁迫后,三疣梭子蟹CYP4C的表达量显著高于对照组,随着胁迫时间的延长出现逐渐降低的趋势,在胁迫48h后表达量达到对照组水平;低盐(11)胁迫条件下,CYP4C的表达水平随着胁迫时间的延长呈现逐渐下降的趋势,且从胁迫6h开始显著低于对照组。研究推测,CYP4C基因参与三疣梭子蟹盐度适应调节,是蜕皮机制的调控因子之一。 第二部分,克隆了三疣梭子蟹蜕皮激素受体(EcR)基因cDNA全长序列。该基因全长2996bp,编码一个由503个氨基酸组成的多肽,预测理论等电点PI为7.33,分子量大小为55.69kDa。同源性及系统进化分析表明,三疣梭子蟹EcR基因与青蟹、拟穴青蟹、大西洋招潮蟹、陆地蟹、美洲螯虾、褐虾、日本对虾的同源性分别为94%、90%、88%、84%、82%、73%、66%。荧光定量RT-PCR结果表明,EcR在肝胰腺、卵巢、肌肉、眼柄、鳃和心脏中均有分布,在肝胰腺中表达量最高,在心脏中最低。高盐(45)胁迫下,EcR基因的表达量在24小时后显著低于对照组,总体呈下降趋势;低盐(11)胁迫条件下,EcR转录组的表达量呈现先降低后上升的趋势,在12小时达到最低,之后逐渐上升,在48小时之后显著高于对照组(P0.05)。 第三部分,分别选取三疣梭子蟹卵裂期、囊胚期、原肠胚期、卵内前无节幼体期、卵内后无节幼体期和溞状幼体期6个代表性发育时期的胚胎作为实验材料,荧光定量RT-PCR测定各个时期EcR基因的表达量变化。结果表明,在胚胎发育过程中,EcR在卵裂期到溞状幼体期均有表达,从卵裂期到前无节幼体期EcR mRNA的表达水平呈显著上升,在前无节幼体期的表达最高,之后从后无节幼体期开始至溞状幼体期,其表达水平又逐渐增加。本研究表明EcR在胚胎发育过程中参与了器官的分化形成等生理反应,在其发育过程中发挥了重要的作用。


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