许氏平鲉微卫星标记开发及群体遗传结构分析

【摘要】：许氏平鲉（Sebastes schlegelii）是我国北方重要的养殖和捕捞鱼类之一，具有很高的经济价值。过度捕捞和近岸生态环境的变化使野生许氏平鲉资源逐渐减少，野生群体遗传多样性受到威胁。对野生群体种质资源状况充分了解的基础上，通过合理的向天然水域投放人工繁殖苗种进行增殖放流（Stock Enhancement），可以在一定程度增加许氏平鲉资源量，保护生物多样性。同时，从野生群体中选育出生长速度快、抗病能力强的优质品种进行人工养殖也具有重要的经济效益和社会效益。微卫星标记技术为许氏平鲉种质资源研究和良种选育工作提供了一个方便、有效的工具。本研究采用磁珠富集法构建许氏平鲉微卫星富集文库，开发出51对具有多态性的微卫星标记。并选用部分高多态性微卫星标记对山东半岛五个地理群体（烟台牟平区、长岛县，日照东港区、威海荣成市、青岛胶州湾）的野生群体遗传结构进行评估。 1许氏平鲉微卫星标记的开发及评价。 用Sau3AI对许氏平鲉基因组DNA酶切并收集400~1000bp的片段，含微卫星序列的DNA片段与生物素标记的寡核苷酸探针(CA)12和(GA)12杂交后被链霉亲和素包被的磁珠捕获，然后与载体连接并转化至DH5α感受态细胞中，构建许氏平鲉微卫星序列富集文库。采用三引物PCR法对353个菌落进行了阳性克隆确认，筛选得到213个阳性克隆，重组率为60.34%。阳性克隆测序结果显示其中188个克隆含微卫星核心序列，占88.26%。核心序列大部分为CA/GT和GA/CT重复单元，其中完美型（Perfect）83个，非完美型（Imperfect）47个，复合型（Compound）58个，分别占44.15%，25.00%和30.85%。 利用软件设计并合成了169对微卫星引物，其中144对引物能扩增出清晰的目的条带。在使用32个长岛野生群体个体对这些引物进行评价时有51对引物表现出了多态性。所有位点上共得到384个等位基因片段，每个位点的等位基因数（Na）为2~21个，平均等位基因数为7.5294；平均观测杂合度（Ho）、平均期望杂合度（He）、平均多态信息含量（PIC）分别为0.5106、0.5794和0.5443。其中高度（PIC0.5）和中度（0.25PIC0.5）多态性位点分别为13个和27个，共占78.43%。对哈迪-温伯格(Hardy-Weinberg)情况进行了检测，发现除HJ3-3，HJ4-45，HJ4-47，HJ5-24和HJ5-154五个位点出现不同程度偏离平衡（P0.05）外，其余位点等位基因频率均符合Hardy-Weinberg平衡。结果说明本研究所筛选的微卫星标记大部分都具有较高的多态性，可以用于许氏平鲉的遗传相关分析。 2五个许氏平鲉地理群体的遗传结构分析。 选用17对微卫星引物分析了山东半岛5个野生群体的群体遗传结构，采用分辨率高的毛细管电泳技术进行基因分型。每个群体所有位点平均等位基因数在14.353到14.824之间，平均观测杂合度为0.785~0.793，平均期望杂合度为0.824~0.841，多态信息含量为0.791~0.808。说明这五个群体的遗传多样性均较高，选择育种的潜力大。近交系数（Fis）显著性检验表明5个群体各位点的平均近交系数为0.025~0.065，荣成群体的平均近交系数最低，青岛群体则出现了极显著的近交现象（P0.01）。5个群体之间的遗传分化指数(Fst)为-0.0027~0.0064，青岛群体与牟平、日照和荣成群体均产生了显著的分化，与长岛群体产生了极显著的分化，但分化指数均小于0.05，表明为各群体间分化程度较低。各群体间的遗传相似性指数为0.8844~0.9350，遗传距离为0.0672~0.1229，青岛群体与各群体间的遗传距离均大于其余各群体间的遗传距离，遗传相似性指数则低于其余群体间的相似性指数，荣成群体和日照群体间的遗传相似性指数最高，遗传距离最小。根据Nei遗传距离采用UPGMA法构建聚类分析图，日照群体和荣成群体聚类后再与长岛群体聚类，然后与牟平群聚为一支，青岛群体单独为一支。主成分分析结果显示群体散点图在第一主成分上基本呈均匀分布状态，青岛群体在第二主成分上与其他群体显示出轻微的区别。以上结果表明，山东半岛附近海域各许氏平鲉群体未出现明显的群体分化，这可能与其在仔稚幼鱼时期的生活习性有关。青岛群体出现的轻度群体分化和群内近交可能与胶州湾相对闭锁的生活环境形成的地理隔离有关。 本研究获得的微卫星标记多态性较高，可用于许氏平鲉群体遗传结构分析，遗传连锁图谱的构建和QTL定位等相关研究。群体遗传结构分析结果将为许氏平鲉种质资源保护和良种选育工作提供基础资料。