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哲罗鲑胰岛素样生长因子Ⅱ原核表达、多克隆抗体的制备及组织表达分析

吴秀梅  
【摘要】:在鱼类胚胎发育过程中,胰岛素样生长因子-II(insulin-like growth factors-II,IGF-II)起着关键的作用。哲罗鲑(Hucho taimen)是鲑科鱼类中最大的个体,其细嫩的肉质、鲜美的味道具有很高的食用与经济价值,目前国内还没有关于哲罗鲑的IGF-II基因的研究。本研究根据Gen Bank里收录的鲑鳟鱼IGF-II基因序列设计引物P1、P2,以哲罗鲑肝脏RNA提取物为模板,利用RT-PCR方法扩增出哲罗鲑IGF-II基因开放阅读框。首先本研究利用生物学软件对成功克隆出的哲罗鲑IGF-II基因开放阅读框进行了生物信息学分析,其中利用Meg Align软件中默认的Clustal W模式对IGF-II核苷酸序列与氨基酸序列进行同源性分析。利用DNAMAN翻译获得IGF-II氨基酸序列,利用Protean软件进行IGF-II蛋白分子量及等电点进行了预测,采用Clustalx 1.83软件和MEGA 5.0软件构建了IGF-II核酸序列系统进化树。其次,本研究根据哲罗鱼IGF-II基因开放阅读框序列,利用Primer软件设计了一对用于做荧光实时定量PCR的引物IGF-II-F、IGF-II-R,利用荧光实时定量PCR方法来检测二龄哲罗鲑IGF-II基因在不同组织中的表达情况。最后本研究将目的基因IGF-II与原核表达载p SUMO连接构建出重组表达载体p SUMO-IGF-II。将该重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta中利用IPTG进行目的蛋白的诱导表达。对包涵体形式存在的原核表达蛋白进行变性/复性后获得较纯的目的蛋白,利用ELISA和MTT方法对目的蛋白进行免疫学活性及生物学活性分析。然后利用有生物活性和免疫活性的目的蛋白免疫小鼠,获得鼠抗血清。利用ELISA方法检测获得的哲罗鲑IGF-II抗体的效价;本研究旨在为哲罗鱼的生长模式和生长繁殖的研究奠定基础。相应的实验结果如下:1.克隆的哲罗鲑IGF-II基因的生物信息学与组织表达分析克隆出的哲罗鲑的IGF-II基因开放阅读框序列经过测序后,用blast和DNAMAN比对分析结果正确后,利用生物信息学软件对目的片段进行分析,结果显示哲罗鲑IGF-II基因的长度为645 bp,编码的蛋白质含有214个氨基酸残基,该蛋白质的相对分子量为24.554 k Da,等电点为9.92;哲罗鲑IGF-II前肽由信号肽、B、C、A、D、E六部分构成;同源性比对和系统进化分析结果显示,哲罗鲑IGF-II与鲑科鱼类IGF-II同源性最高,其中与大西洋鲑的IGF-II同源性最高(98%),该基因在进化的过程中有着高度保守的进化特性;荧光定量PCR实验结果显示,该基因在肝脏中的表达量最高,在心、鳃、脾、后肠、头肾、胃中次之,而在前肠和脑中的表达量最低。2.哲罗鲑IGF-II基因的原核表达、活性鉴定与抗体制备将测序结果正确的目的片段与原核表达载p SUMO连接,经PCR和Bsa I和Bam H I双酶切验证成功构建出重组表达载体p SUMO-IGF-II,将重组质粒转化到表达菌株Rosetta中后,经IPTG诱导,产生了N端带有SUMO标签的重组蛋白,经SDS-PAGE电泳分析显示,约在40 k D处含有清晰的条带,与预期结果相符。并且检测结果显示目的蛋白是以包涵体形式存在的。然后利用8 M的尿素进行蛋白变性,2 M的尿素复性,经过透析纯化后获得高浓度的目的蛋白。利用ELISA对目的蛋白进行免疫学活性分析。ELISA结果显示该目的蛋白能够与商品化的抗鲑鳟鱼IGF-II的抗体发生特异性反应,并且呈现抗原浓度依赖性,该结果说明本研究获得了具有良好免疫原性的IGF-II蛋白;在利用MTT方法测定IGF-II蛋白对鲤(Cyprinus carpio)上皮细胞(Epitheliaoma Papulosum Cyprini,EPC)和虹鳟(Oncorhynchus mykiss)性腺细胞(Rainbow trout gonad,RTG-2)的增殖效果来鉴定IGF-II蛋白的生物学活性,结果显示所表达的哲罗鲑IGF-II蛋白能够有效的刺激EPC细胞和RTG-2细胞增殖。该结果表明利用原核表达系统获得的哲罗鱼IGF-II蛋白具有良好的生物学活性。利用目的蛋白免疫小鼠获得的鼠抗IGF-II抗体,经ELISA检测IGF-II蛋白抗体的效价为1:52000。以上这些实验结果为以后研究哲罗鲑IGF-II基因及IGF-II蛋白对哲罗鲑的生长和繁殖的影响提供了非常有价值的实验资料。


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