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畜禽—鱼复合养殖模式中气单胞菌Ⅰ类整合子的分子流行特征

冯永永  
【摘要】:气单胞菌(Aeromonas)是隶属气单胞菌科(Aeromonaseae)的一类革兰氏阴性短杆菌,多见于江河或沿岸的海水中。气单胞菌是一种典型的条件致病菌,是鱼类的重要病原菌,亦可引起人畜的偶发性感染,致肠道疾病或食物中毒。在水产养殖中,气单胞菌可以单独或混合其它细菌感染水产动物,是威胁我国淡水养殖业发展的主要因素之一。随着抗菌药物在水产动物病害防治中的广泛应用,在抗菌药物的选择压力下,不可避免地导致耐药细菌的出现。抗菌药物的长期应用无意中又对耐药菌起到了富集筛选的作用,进而使得药物药效降低,同时还存在将耐药性传播到人源致病菌的风险。已有研究表明,外源性耐药基因的获得是多数耐药菌甚至多重耐药菌产生的主要原因。细菌整合子-基因盒系统是研究细菌多重耐药的热点之一。整合子是在细菌中发现的天然克隆表达系统,存在于细菌质粒或染色体上,可介导细菌耐药基因的水平转移引起细菌耐药甚至多重耐药。典型的I类整合子由携带编码整合酶基因intI、启动子和重组位点attI构成的5’保守区(5’CS)和由季铵盐化合物和溴乙锭耐药基因qac EΔ1、磺胺耐药基因sul1以及功能不明的开放读码框orf5构成的3’保守区(3’CS)以及中间的带有一个或多个基因盒的可变区组成。携带耐药基因盒的整合子可以通过转座子或者接合质粒进行传播和转移,促使了多重耐药菌株的形成和传播。为了解广东地区畜禽-鱼复合养殖模式下气单胞菌整合子流行情况及其耐药特征,从广东省5个不同畜禽-鱼复合养殖场采集的猪粪、鹅粪、鱼、池塘水及池塘底泥样品中分离纯化气单胞菌,对纯化后的气单胞菌通过微量二倍稀释法测定其对磺胺间甲氧嘧啶(SMM)、磺胺二甲嘧啶/甲氧苄啶(SM2/TMP)、磺胺嘧啶/甲氧苄啶(SD/TMP)、磺胺甲噁唑/甲氧苄啶(SXT)、四环素(TE)、多西环素(DO)、萘啶酸(NA)、诺氟沙星(NOR)、恩诺沙星(ENR)、环丙沙星(CIP)、新霉素(N)、庆大霉素(CN)、阿米卡星(AK)、链霉素(S)、氨苄西林(AMP)、头孢噻肟(CTX)、甲砜霉素(THI)、氟苯尼考(FFC)、氯霉素(C)、呋喃妥因(F)共20种药物的敏感性。PCR扩增I类整合子整合酶基因intI1、qacEΔ1和sul1基因,并分析其基因盒阵列结构。根据整合子检测结果,选取整合子阳性菌株,通过肠杆菌科细菌基因间重复序列聚合酶链式反应(Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus Polymerase Chain Reaction,ERIC-PCR)分析整合子阳性菌株的同源性,并提取整合子阳性菌株质粒,琼脂糖凝胶电泳分析其质粒图谱。本研究中共分离纯化到317株气单胞菌,其中鱼源127株,池塘水源94株,池塘底泥源78株,猪粪源18株。分子鉴定到8个种,其中维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)和豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)为主要的种属,两者共占总菌株数的一半。317株气单胞菌对20种药物耐药程度不一,氨苄西林、磺胺间甲氧嘧啶、萘啶酸的耐药率相对较高,分别为96.85%、62.15%和53.95%。不同来源的气单胞菌中,猪源和鱼源的气单胞菌耐药率要高于水源和池塘底泥源的气单胞菌。对分离到的317株气单胞菌PCR扩增I类整合子整合酶基因intI1结果显示,intI1的检出率为15.77%,鱼源和猪源的整合子检出率高于环境源的。整合子阳性菌对测试的12种药物的耐药率显著高于阴性菌,且表现为多重耐药;50个I类整合子共检测到16种耐药基因盒,包括了编码氨基糖苷类耐药基因aadA1、aadA2、aac6-Ⅱ、aacA4,甲氧苄啶耐药基因drfA1、dfrA12、dfrA15、dfrA17、dfrB4,β内酰胺类耐药基因blaOXA-10、blaOXA-21,氯霉素耐药基因catB3、catB8,利福平耐药基因arr2、arr3以及质粒介导的喹诺酮类耐药基因aac(6’)-Ib-cr。携带了不同类耐药基因盒的整合子阳性菌还表现出所对应的对甲氧苄啶、链霉素、氯霉素类等的耐药表型,由此推测整合子的存在与细菌的多重耐药密切相关。通过对50株整合子阳性菌ERIC-PCR聚类分析发现,50株气单胞菌可聚类为16个基因型,携带不同基因盒的菌株聚类结果具有一定差异。基因盒阵列dfrA12-orfF-aadA2和dfrA17其ERIC型呈多样化分布,而catB8、aac(6’)-Ib-crarr-3、aac6-Ⅱ-blaOXA-21-catB3的ERIC型相对集中,其中携带aac(6’)-Ib-cr-arr-3基因盒的菌株质粒图谱、耐药谱均具有相似的结果,由此推测复合养殖模式中整合子基因盒的传播方式既有克隆传播,也可能通过质粒进行水平转移。研究表明,I类整合子分布存在于广东地区畜禽-鱼复合养殖模式下不同来源气单胞菌,并介导细菌对多种抗菌药物耐药。有必要开展畜禽-鱼复合养殖模式下细菌耐药性的传播机制研究,为水产养殖合理用药提供依据。


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