合浦珠母贝糖胺聚糖的分离纯化、结构表征及免疫调节作用研究

【摘要】：合浦珠母贝贝肉中的糖胺聚糖具有较强的生物活性,且近几年来我国合浦珠母贝贝肉(即内脏团,软体部)年产量达2000 t以上,如何更好利用这些资源,需要我们深入研究合浦珠母贝肉中糖胺聚糖粗品的提取、样品的纯化、结构分析以及生物活性。本文旨在对合浦珠母贝中糖胺聚糖的提取工艺、分离纯化、结构分析及免疫调节作用开展系统研究,以期开发出合浦珠母贝贝肉的营养功能性制品。本文利用响应面法确定最佳提取工艺,以合浦珠母贝全脏器为原材料,经解冻匀浆和热水浸提后,采用枯草杆菌中性蛋白酶和胰蛋白酶双酶酶解,sevage法除蛋白两次,清液醇沉得糖胺聚糖粗制品GAG,粗制品经DEAE-52离子交换柱纯化后得精制品GAG1、GAG2。通过苯酚-硫酸法、1,9-二甲基亚甲基蓝法、Bradford法、明胶-氯化钡法、Orcinol法、Carbzole法、Wagner法、琼脂糖凝胶电泳法、高效凝胶色谱、红外光谱、超高效液相色谱对GAG1、GAG2的理化性质及一级结构进行分析。构建了以环磷酰胺诱导的免疫功能低下小鼠模型,并应用于合浦珠母贝贝肉糖胺聚糖免疫功能调节作用的研究。得到如下结果和结论:(1)在单因素试验基础上,糖胺聚糖含量乘以粗制品得率所得的值Y/(×10-4)作为响应值,加酶量、液料比、酶解时间为影响因子,利用响应面试验分析法优化GAG的粗提工艺,得最佳提取工艺:加酶量为1.14%(枯草杆菌中性蛋白酶与胰酶的比例为7:8(g/g));液料比为3:1;酶解时间为4.1 h。在此条件下,糖胺聚糖粗制品得率为0.518%,糖胺聚糖含量为40.9%,经DEAE-52柱纯化后得到GAG1、GAG2两种组分,通过1,9-二甲基亚甲基蓝法对GAG1、GAG2进行含量测定可知其中糖胺聚糖含量分别为82.2%和80.3%;(2)通过化学方法对GAG1、GAG2进行分析测定可得:总糖含量分别为12.87%和10.78%,蛋白质含量分别为6.01%和5.86%,己糖醛酸含量分别16.89%和21.57%,硫酸基含量分别为15.35%和18.72%,氨基己糖含量为37.93%和11.14%。GAG1与GAG2的Ah/Al吸光值之比分别为10.13、9.85,C/O值分别为0.531、0.96,可得GAG1中的己糖醛酸为艾杜糖醛酸,GAG2中的己糖醛酸为葡萄糖醛酸,氨基己糖均为氨基葡萄糖,硫酸基可能都是O-硫酸基,但也有可能存在少量N-硫酸基。从琼脂糖电泳图可以看出DEAE-52离子交换色谱可将糖胺聚糖粗制品有效分离成均一组分GAG1、GAG2。由不同的葡聚糖标准分子量绘制标准曲线,其线性三阶回归方程为:Log Mol Wt=9.90e+001-1.61e+001 T^1+9.50e-001 T^2-1.93e-002 T^3(R=0.999921),根据标准曲线计算,可得GAG1的数均分子量Mn=8358076、重均分子量Mw=16356464;GAG2的数均分子量Mn=25992、重均分子量Mw=44597。由此可知,GAG1的聚合度远大于GAG2,两者均为单一组分,且粗制品中GAG1为主要成分,提示GAG1可能具有较高的生物活性。红外光谱法表征合浦珠母贝糖胺聚糖GAG1、GAG2中的主要官能团,分析可知样品中存在普通糖类物质所具有的特征吸收峰,同时存在硫酸基的吸收峰,符合糖胺聚糖的结构特征。通过酸水解将样品分解成单糖并进行PMP衍生化,利用超高效液相色谱法测定样品中的单糖组分,可知GAG1中含有D-氨基葡萄糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、岩藻糖,GAG2中含有D-氨基葡萄糖、甘露糖、D-葡萄糖醛酸、鼠李糖、葡萄糖、木糖、岩藻糖。(3)合浦珠母贝糖胺聚糖对环磷酰胺引起的免疫抑制呈现剂量依赖性的正相关作用,能够加速脾脏指数、外周血白细胞数和骨髓细胞数的恢复,增强脾淋巴细胞增殖和转化能力、脾NK细胞杀伤活性和腹腔巨噬细胞吞噬能力,升高血清IL-2水平,同时还能较好地改善小鼠的生活质量。结果表明,合浦珠母贝糖胺聚糖对小鼠免疫器官、免疫细胞和细胞因子等免疫功能方面具有较强的调节作用。