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海洋抑菌放线菌的筛选、鉴定及其抑菌活性物质研究

张孟  
【摘要】:随着抗生素的大量使用,病原菌耐药性逐渐增强。因此,新型生物活性物质的持续开发以应对病原菌耐药性增强的速度成为当前医药界的迫切需要。海洋微生物资源丰富,环境独特使得海洋微生物能够产生许多结构新颖的生物活性物质。放线菌是产生生物活性物质的主要产生菌,从海洋中筛选产生物活性物质的海洋放线菌是近年来研究热点,且很多新型海洋生物活性物质具备良好的应用前景。本研究从东海海泥样品中筛选出一株抑菌谱广、抑菌活性强的海洋放线菌,并对其进行了鉴定;研究了抑菌物质的理化性质;优化了该菌的发酵培养基;并初步研究了该菌对单核细胞增生李斯特菌ATCC19114的作用机理。具体内容如下:1.海洋抑菌放线菌的筛选与鉴定采用琼脂块法初筛,打孔扩散法复筛从东海海泥样品中筛选出12株具有抑菌活性的海洋放线菌,其中Y10、Y11、Y15、Y16和Y21具有较强的抑菌性,且Y15在四种发酵培养基中均能产生抑菌活性物质。通过抑菌谱分析表明Y15抑菌谱最广,对20株指示菌中的18株表现出抑菌作用,尤其对单核细胞增生李斯特菌,金黄色葡萄球菌,维氏气单胞菌抑菌作用极强,因此被确定为目标菌。通过形态学观察和16S rRNA基因序列同源性分析鉴定菌株Y15属于小单孢菌属,获得GenBank登录号为:KU517850。2.Y15抑菌物质性质研究研究了Y15抑菌物质的产生随时间变化关系曲线和Y15传代稳定性。对Y15抑菌物质温度稳定性、pH稳定性、紫外稳定性、酶水解稳定性和极性大小进行了分析。Y15在148 h抑菌活性最大,达到480 AU/mL,在168-216 h保持平衡为320AU/mL,在48-216 h为生长对数期,在216-288 h为生长稳定期。Y15传代稳定性较好,在第1代到第7代菌体保持稳定。Y15抑菌活性物质在-20-60°C抑菌活性保持稳定,在80-120°C活性逐渐下降。Y15抑菌活性物质在pH 7.0-10.0之间保持稳定的抑菌活性,在酸性和强碱性条件下抑菌活性均下降。Y15抑菌物质具有良好的紫外稳定性。抑菌物质对四种酶水解作用下保持稳定,表明Y15抑菌物质为非蛋白和多肽类物质。Y15抑菌物质被乙酸乙酯萃取的效果最佳,浓缩之后活性可达5200 AU/mL,表明抑菌物质具有中等极性。3.Y15发酵培养基优化通过单因素实验优化了Y15发酵培养条件,利用响应面法优化了Y15发酵培养基成分。确定最优培养条件为温度30°C,培养基初始pH为7.20,接种量为4%,摇床转速为180 rpm。单因素实验选择可溶性淀粉、牛肉膏、胰蛋白胨、NaCl、K2HPO4、MgSO4和FeSO4为影响因子;通过Plackett-Burman实验确定影响抑菌活性物质产生的显著因素为K2HPO4、可溶性淀粉和牛肉膏;最陡爬坡实验确定中心点为:K2HPO4为1.00 g/L,可溶性淀粉为25.00 g/L,牛肉膏为18.00 g/L;CCD实验确定最佳培养基配方为:K2HPO4为1.03 g/L,可溶性淀粉为27.67 g/L,牛肉膏为18.30 g/L,胰蛋白胨为7.50 g/L,FeSO4为0.02 g/L,NaCl为0.38 g/L,MgSO4为0.75 g/L,在此浓度水平下预测最大抑菌活性为1174.63 AU/m L。验证性实验测得的实际抑菌活性为1236.79±14.56 AU/mL,与预测值无显著差异,相比于优化前抑菌活性提高了3.86倍。4.Y15抑菌活性物质抑菌机理初步研究探讨了Y15抑菌物质抑制单核细胞增生李斯特菌ATCC19114的作用机理。结果表明Y15抑菌物质对指示菌生长曲线具有显著影响;对细胞壁无损伤作用;胞内离子发生泄露,而大分子物质没有泄露,推断对细胞膜损伤不大;扫描电镜下,经Y15抑菌物质处理的指示菌细胞形态发生皱缩、弯曲,但并未导致细胞裂解,证实上述推断。另一方面,Y15抑菌物质对指示菌DNA并无影响,但会使指示菌可溶性蛋白表达量减少,推断Y15的作用机理可能是通过影响指示菌胞内可溶性蛋白表达和改变细胞膜通透性使指示菌的生长受到抑制甚至死亡,具体机理有待进一步研究。小单孢菌是稀有放线菌,且小单孢菌菌产生的生物活性物质仅次于链霉菌,具有重要开发价值。Y15与M.endolithica具有很高的相似度,M.endolithica是一株小单孢菌菌新种,目前发现的该菌并未有抑菌活性的报道,Y15却具有极好的抑菌性。Y15抑菌谱广,对水产品病原菌如L.monocytogenes,S.aureus,A.veronii和V.parahaemolyticus均具有极强的抑菌性,因此Y15在水产品病原菌防治中也具有一定应用意义。本文的研究结果可以为后期抑菌物质的分离纯化、实际应用和基于分子生物学基础上的机理研究提供理论依据。


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