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三疣梭子蟹鳃表达谱分析及3个神经肽基因在低盐适应中的功能研究

孙东方  
【摘要】:三疣梭子蟹Portunus trituberculatus属于甲壳纲Crustacea、十足目Decapoda、梭子蟹科Portunidae,是重要的海洋经济动物,在我国分布广泛。三疣梭子蟹属大型广盐性水生甲壳动物,可在盐度为13.7-47.7的环境中生存,具有生殖洄游习性,其产卵地多位于港湾或河口低盐区,并在深海高盐区越冬。盐度成为影响三疣梭子蟹生长发育至关重要的环境因子之一,对其摄食、蜕皮、生长、代谢、免疫等具有重要作用。因此,进行盐度适应机制研究对三疣梭子蟹耐盐良种的培育具有重要意义。为解析三疣梭子蟹盐度适应机制,本论文设计了以下研究内容:首先,通过新一代测序技术对盐度耐受性性状差异三疣梭子蟹鳃组织进行高通量表达谱测序,通过比较转录组分析发掘盐度适应相关基因;其次,在比较转录组分析基础上,我们发现神经肽家族基因在三疣梭子蟹盐度耐受性性状差异家系间以及盐度胁迫后显著差异表达,推测神经肽可能在三疣梭子蟹盐度适应中具重要作用。因此,挑选了蝗抗利尿肽、甲壳动物心激肽、甲壳动物高血糖素等基因,通RCAE、染色体步移等技术获得c DNA或基因组全长序列,并进一步通过qPCR、RNAi及酶活测试等分子生物学技术解析其在低盐适应中的分子机制,主要研究结果如下:1.低盐胁迫下三疣梭子蟹鳃表达谱分析采用新一代测序技术对盐度耐受性性状差异三疣梭子蟹鳃组织进行高通量表达谱测序,测序10个样本平均产生23,941,392条clean reads,与参考序列比对率为86.74%。利用比较转录组学方法发掘差异表达基因9,475条,涉及离子转运蛋白基因、离子通道蛋白基因、神经肽基因和氨基酸代谢相关基因等。比较低盐耐受型家系和低盐敏感型家系差异基因发现,离子转运基因显著差异表达,包括Na~+/K~+-ATPase(上调)、V-ATPase(上调)、碳酸酐酶(上调)、几丁质酶(下调)和钙网蛋白(下调)等,此外热休克蛋白、代谢相关的精氨酸激酶等均显著上调。GO富集分析结果显示,差异基因主要富集于生物调节、细胞过程、代谢过程、单有机体过程、细胞组分、细胞膜、细胞器、结合、催化活性、转运活性等GO条目。KEGG信号通路富集结果显示,差异基因主要富集于代谢通路,吞噬小体通路,癌通路和核糖体蛋白通路。此外我们从转录组中筛选到33个神经肽基因及相关受体基因,从表达谱中筛选到三个盐度相关的神经肽基因(蝗抗利尿肽、甲壳动物心激肽、甲壳动物高血糖素),并且显著差异表达,为我们后续研究提供了实验基础。2.低盐胁迫下蝗抗利尿肽基因的表达分析采用RACE技术克隆了三疣梭子蟹蝗抗利尿肽基因(PtNP)。PtNP基因全长1920 bp,5’非编码区237 bp,3’非编码区1373 bp,开放阅读框309 bp,编码102个氨基酸,预测分子量10.8 kDa,理论等电点7.42。PtNP含有12个半胱氨酸残基,具十足目动物蝗抗利尿肽典型的特征。同源性和系统进化分析表明,PtNP与拟穴青蟹NP4的同源性最高(89%),并且三疣梭子蟹与拟穴青蟹首先聚为一支。组织表达分析发现,PtNP基因在脑组织中的相对表达量最高,其次是鳃和眼柄,在卵巢、肌肉、心脏和肝胰腺中表达量较低或不表达。分析PtNP基因在低盐胁迫过程中的表达模式发现,低盐胁迫可显著改变PtNP基因在脑、鳃和眼柄组织中的表达变化,整体呈上调表达趋势,其中在脑、鳃和眼柄中表达量分别最高上调7.7倍、2.8倍和2.6倍(P0.05)。去除眼柄后,PtNP基因在鳃中的表达成上升趋势,且去除双侧眼柄组的表达量显著高于去除单侧眼柄组(P0.05)。本研究结果表明PtNP基因在三疣梭子蟹盐度适应中可能发挥一定作用且受神经内分泌系统的调控。3.甲壳动物心激肽基因克隆及在低盐适应中的功能验证采用RACE技术克隆获得三疣梭子蟹甲壳动物心激肽(CCAP)基因。该基因全长606 bp,5’端非编码区72 bp,3’端非编码区108 bp,开放阅读框426 bp,编码141个氨基酸,预测分子量15.6 kDa,理论等电点9.55。同源性分析表明,三疣梭子蟹CCAP与拟穴青蟹、蓝蟹的CCAP同源性较高,分别为85%和82%。系统进化分析显示,三疣梭子蟹与蓝蟹首先聚为一支,之后的聚类为拟穴青蟹。组织表达分析发现,CCAP基因在胸神经节中的相对表达量最高,其次是脑和眼柄组织。通过分析CCAP基因在低盐胁迫过程中的表达规律发现,低盐可显著改变CCAP在胸神经节中的表达模式,在24、48和72h实验组的表达量显著高于对照组(P0.05)分别为对照组的1.73,2.16和2.19倍。体外注射CCAP多肽可降低三疣梭子蟹在低盐条件下的死亡率,并诱发Na~+/K~+-ATPase和V-ATPase酶活力显著提高。本实验结果暗示CCAP可能通过调控三疣梭子蟹Na~+/K~+-ATPase和V-ATPase活力,从而发挥一定的盐度适应功能。4.高血糖素DNA全长克隆及在低盐适应中的机理研究利用PCR扩增和染色体步移技术获得CHH基因组及其启动子序列。三疣梭子蟹CHH基因组包含4个外显子和3个内含子,全长3849bp,通过可变剪接产生两种转录本Pt-CHH1和Pt-CHH2。Pt-CHH1由外显子1,2和4组成,Pt-CHH2由外显子1,2,3和4组成。获得的CHH基因启动子序列长度约为3kb。运用生物信息学对CHH基因全长分析,结果显示,转录起始位点(0bp)上游31 bp处存在TATA box,核心启动子区位于-40~+9 bp,同时在启动子上发现多个转录因子结合位点(Oct-1、NF-kappa B、GATA-1、TBP、AP-1等)。低盐胁迫下,Pt-CHH2基因在鳃组织中的表达模式发生了显著变化,整体呈上调表达趋势;注射dsRNA后Pt-CHH2基因在鳃组织中的表达量显著下降,并且使得Na~+/K~+-ATP和碳酸酐酶酶活力下降。研究结果表明,CHH基因在三疣梭子蟹渗透压调节中发挥了一定作用,可能通过调节Na~+/K~+-ATPase和碳酸酐酶酶活力对体内渗透压进行调节。


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