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半滑舌鳎性逆转遗传解析

崔瑜  
【摘要】:性逆转现象在昆虫、两栖动物、爬行动物和鱼类中被发现,是一种复杂的生物学现象,这种现象能够改变群体的性别比例,使育种过程变得更加复杂。半滑舌鳎是我国黄渤海区重要海水养殖品种之一,自规模化养殖以来,由于其肉质鲜美,生长速度较快等优点受到消费者和养殖户的青睐,价格居高不下。半滑舌鳎性别差异明显,雌性生长速度约为雄性的2~4倍;在性别发育过程中,部分遗传雌性能够逆转成伪雄鱼,导致群体中雌性率降低。在实际生产中,很难在发育早期将雌性和伪雄个体区分开来,大大增加了养殖成本。本实验将性逆转作为一个性状,通过全基因组关联分析鉴定出一个新的与半滑舌鳎性逆转密切相关的SNP。为进一步探究半滑舌鳎性逆转的遗传特性和性别决定机制,性别控制及其育种提供理论支持和参考资料。主要研究结果如下:1)将性逆转作为一个二项性状,对171尾Cyn_Z_6676874位点为Z~TW型的个体进行全基因组关联分析鉴定出一个新的与半滑舌鳎性逆转密切相关的单核苷酸多态性位点,命名为Cyn_Z_8564889。该位点位于Z染色体上,定位到Dmrt1(Doublesex and mab-3 related transcription factor 1)基因的第三个内含子上,包括两个等位基因A和G,检测到该位点存在杂合,可能是由于Dmrt1在基因组上有多拷贝,雌性个体有三种基因型,Z~(AA)W,Z~(GG)W和Z~(AG)W。2)分别鉴定群体2中的259尾遗传雌鱼的Cyn_Z_6676874和Cyn_Z_8564889位点基因型,同时利用组织切片方法显微镜下观察这些个体的生理性别。结果显示在相同的环境条件下,当Cyn_Z_6676874位点基因型为Z~AW时,半滑舌鳎雌性个体不发生性别逆转;当Cyn_Z_6676874位点基因型为Z~TW时,若Cyn_Z_8564889位点为GG则不发生性别逆转,若Cyn_Z_8564889位点为AA或AG,遗传雌性个体发生性逆转。两个SNP之间的相互作用阐明了半滑舌鳎性逆转的遗传机制,能够在发育初期准确判断半滑舌鳎个体是否发生性逆转。同时利用半滑舌鳎遗传性别鉴定引物分别鉴定伪雄鱼个体的鳍条和精液DNA中性染色体类型,结果显示其伪雄鱼不产生或产生较少的W精子,两个SNP之间的相互作用和伪雄鱼不产生W精子共同阐明了半滑舌鳎性逆转的遗传结构。3)针对Cyn_Z_8564889位点的序列特点,开发出了一对酶切扩增多态性(cleaved amplified polymorphic sequence,CAPS)标记。可用于大样本时快速检测该位点的基因型,很大程度上节约了检测时间和成本。4)对Cyn_Z_8564889位点基因型为Z~(AG)W的个体克隆测序及不同单倍型Dmrt1外显子测序,发现第二外显子上与Cyn_Z_8564889连锁的2个位点的错义突变(Missense Mutation)导致编码氨基酸种类发生改变,分别由缬氨酸变为异亮氨酸,丙氨酸变为丝氨酸,导致了不同单倍型蛋白二级结构不同,推测Dmrt1是半滑舌鳎性逆转的基础。5)克隆了半滑舌鳎Fbxl17(F-box and leucine rich repeat protein 17)基因的蛋白编码序列(Coding Sequence,CDS)全长并推导其编码的氨基酸序列。发现该基因开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)全长1956 bp,可编码651个氨基酸,理论分子量为70.96 kD,理论等电点PI为8.06。氨基酸序列分析显示:Fbxl17具有一个由42个氨基酸组成的F-box结构域,以及11个富亮氨酸重复序列LRR,属于F-box蛋白家族的FBXL亚家族;实时荧光定量PCR分析显示,Fbxl17在不同时期,不同性别的半滑舌鳎性腺组织中的表达模式基本相同,雌性中表达量最低,雄性最高。随着个体性成熟逐渐完成,伪雄鱼和雄鱼表达量趋于一致。本研究针对半滑舌鳎实际生产中存在的的实际问题,以已经发现的性逆转相关的SNP(Cyn_Z_6676874)为基础,利用GWAS找到一个与半滑舌鳎性逆转相关且与已发现位点相互作用的新的SNP位点(Cyn_Z_8564889),从遗传上对半滑舌鳎性逆转现象的发生进行解析。两个SNP位点都位于Z染色体上,只有当Cyn_Z_6676874的T等位基因和Cyn_Z_8564889位点的A等位基因同时出现时,才会发生性别逆转;通过验证了伪雄鱼个体不产生或产生少量W精子,共同解释了伪雄鱼后代都是伪雄鱼的原因;对新的SNP所在基因Dmrt1不同单倍型的验证,第二外显子上的错义突变导致Dmrt1二级结构发生改变的现象猜测了半滑舌鳎性逆转发生的遗传机制,具有一定的理论意义和实践价值;此外,该研究首次克隆了半滑舌鳎Fbxl17基因的CDS全长。


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