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近江牡蛎多糖多肽联产制备工艺、结构鉴定及活性评价

杨大俏  
【摘要】:近江牡蛎(Crassostrea rivularis)是瓣鳃纲牡蛎目牡蛎科海洋双壳类软体动物,是我国四大养殖贝类之一,在广东、广西、福建、山东和浙江等沿海地区有大量人工养殖。其肉质鲜美,营养丰富,含有丰富的蛋白质和碳水化合物,有“海洋牛奶”的称号,中医学认为,牡蛎重镇安神,滋阳补阴,软坚散结,收敛固涩,对惊悸失眠、劳神伤脾、阳痿、腰痛和崩漏等症有一定疗效。中国拥有丰富的海洋资源,2017年中国牡蛎行业产量达到487.9万t,是中国一种重要经济贝类,但是,目前中国对牡蛎产品除直接食用外,大多通过简单加工直接进入食品市场,产品附加值不高,牡蛎产业发展受到制约。研究生物活性物质是海洋研究的主导方向,当前国内外对海洋活性成分提取分离的研究正如火如荼的开展中:相关研究报道显示牡蛎多糖具有多种药用功能,对牡蛎多糖的深入研究不仅造福牡蛎产业,更将造福全人类;天然海洋活性多肽具有较高的稳定性,但是海洋鱼虾贝类中的生物活性肽的研究尚处于实验室阶段。本研究的主要研究内容与结果如下:1.利用响应面法优化近江牡蛎多糖多肽联产的工艺条件。单因素实验研究酶解时间、酶配比、料液比对水解度、多肽含量、酸性糖含量以及多糖含量的影响,在此基础上,应用Design Expert 8.0.6建立数学模型,以多肽含量、酸性糖含量和多糖含量为响应值,进行三因素三水平的响应面分析。结果表明,酶解法联产制备近江牡蛎多糖多肽的最佳工艺为:酶解2.0 h,添加质量分数为0.58%的Alcalase酶和质量分数0.22%的胰蛋白酶,料液比1:3.6。此条件下进行重复试验,验得近江牡蛎全脏器匀浆中粗多糖得率为21.29%,含85.18%多糖,20.02%酸性糖以及10.84%多肽;粗多肽得率为31.41%,含84.03%多肽,0.11%酸性糖以及5.68%多糖。2.选用不同截留分子量的超滤膜对近江牡蛎酶解液进行分级分离,将近江牡蛎酶解液按照分子量分布分成0~8 kDa(CRRS-A)、8~200 kDa(CRRS-B)、200 kDa~0.2μm(CRRS-C)三个组分,并对不同分子量段的近江牡蛎酶解液进行理化性质分析、体外抗氧化活性研究及初步结构鉴定。结果表明:CRRS-A组分主要由多肽组成,含量达到(87.26±1.65)%,分子量2 kDa,由10种化合物组成,具有较高的体外抗氧化活性(DPPH自由基清除能力、羟基自由基清除能力较高,超氧阴离子清除能力高于抗氧化剂谷胱甘肽(GSH),达到(116.67±3.22)U/g);CRRS-B组分含有(75.82±0.28)%的多糖,分别含有己糖醛酸(5.06±0.60)%、甲基戊糖(31.23±1.29)%、硫酸基(23.47±0.7)%、氨基己糖(2.29±0.04)%,分子量150kDa,为吡喃型多糖化合物,总体抗氧化能力优于抗氧化剂2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚BHT,劣于GSH。CRRS-C组分为吡喃型糖蛋白,分子量达7152 kDa,体外抗氧化活性较差。3.对8~200 kDa近江牡蛎酶解液膜分离组分进行分离纯化,得CRP-1~3,经过理化性质测定后得知CRP-1的总糖含量为(32.40±0.89)%,相对分子质量为124.5kDa,是组分均一的多糖,由甘露糖、核糖、氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、氨基半乳糖、半乳糖、阿拉伯糖组成,9种单糖的物质的量比为5.55:0.32:9.08:0.47:0.66:48.13:3.57:8.53:0.30。CRP-2的总糖含量为(78.50±1.90)%,相对分子质量为67.0 kDa,是由甘露糖、核糖、氨基葡萄糖、葡萄糖、氨基半乳糖、半乳糖组成,6种单糖的物质的量之比为7.79:0.41:12.69:32.08:4.98:15.92。CRP-3的总糖含量为(73.46±2.19)%,相对分子质量为8.3 kDa,是由氨基葡萄糖、半乳糖醛酸、葡萄糖组成,3种单糖的物质的量之比为8.91:5.71:10.15。傅里叶变换红外光谱分析结果显示,CRP-1是多醛基吡喃环糖苷的多糖化合物;CRP-2是多酮基不饱和多糖化合物;CRP-3是多酮基含羧基多不饱和多糖化合物。4.对0~8 kDa近江牡蛎酶解液膜分离组分进行分离纯化,得F1~F5,经过相应实验得知近江牡蛎酶解液膜分离组分的自由基清除能力较高,且其多肽纯化组分具有较强的体外抗氧化活性,其最高还原力为(2.54±0.17)OD(700 nm,5.0 mg/mL),DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基清除能力的IC_(50)分别为(21.75±7.08)μg/mL、(18.7±6.49)μg/mL、(11.00±5.65)μg/mL。5种组分经过半制备-RPLC富集后,经过UPLC-Q-Tof-MS/MS鉴定得知,F1是分子量为652.76 Da,氨基酸序列为Gly-Trp-Val-Asp-Tyr的5肽;F2是分子量为850.07 Da,氨基酸序列为Ser-Met-Phe-Arg-Phe-Tyr的6肽;F3是分子量为676.82 Da,氨基酸序列为Tyr-Arg-Ile-Pro-Glu的5肽;F4是分子量为870.14 Da,氨基酸序列为Arg-Lys-Arg-Trp-Pro-Lys的6肽;F5是分子量为943.22 Da,氨基酸序列为Tyr-Ala-Lys-Arg-Cys-Phe-Arg的7肽。5.以小鼠巨噬细胞系RAW264.7为模型,证明了近江牡蛎多糖CRRS-B和CRP-1~3能够增强巨噬细胞中性红的吞噬能力和对FITC-标记大肠杆菌的吞噬能力,具有免疫调节活性;且近江牡蛎多糖CRRS-B和CRP-1~3能够显著增强小鼠巨噬细胞效应因子NO和细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌,上调mRNA表达iNOS、TNF-α、IL-6和IL-1β等细胞因子并诱导NO、TNF-α、IL-6、IL-1β等细胞因子的分泌。且近江牡蛎纯化多糖对小鼠巨噬细胞的吞噬能力大小为:CRP-3CRP-1CRP-2。


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