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钙调蛋白基因参与Pyropia chauhanii单孢子的形成与放散的研究

李海东  
【摘要】:Pyropia chauhanii是一种采自印度半岛的紫菜,能够通过单孢子的形成和放散完成无性繁殖。单孢子作为次级苗源在生产上意义重大,但其分子机制仍不清楚。钙离子(Calcium,Ca~(2+))作为第二信使可参与调控植物的生长发育过程,这种调控主要是通过钙离子的特异性受体-钙调蛋白(Calmodulin,Ca M)来实现的。Ca~(2+)-Ca M复合体可能在紫菜的单孢子的分子机制中发挥重要作用。本研究的目的是探究钙调蛋白基因与P.chauhanii单孢子的形成和放散的关联性。本研究以P.chauhanii野生型品系PC-WT为材料,基于实验室转录组数据分析筛选出单孢子的放散过程中表达量上调的关键Ca M基因,克隆获得一条全长为1812 bp的基因片段,命名为Pc-Ca M7。生物信息学分析表明,Pc-Ca M7的开放阅读框(ORF)共456 bp,编码151个氨基酸。预测Pc-Ca M7蛋白的分子量约为16.69KDa,等电点为4.36,分子式为C_(713)H_(1154)N_(192)O_(249)S_9。通过结构域分析可知,Pc-Ca M7蛋白的4个EF-hand区域以及保守的钙离子结合位点,均符合典型钙调蛋白家族的蛋白结构特征。在5个已报道基因组的红藻物种中对Pc-Ca M7进行进化分析,结果显示Pc-Ca M7与同一直系同源组中的坛紫菜(Pyropia haitanensis)、条斑紫菜(Pyropia yezoensis)以及脐型紫菜(Porphyra umbilicalis)的序列高度相似,表明该基因属于保守的Ca M家族成员。在正常培养条件下,P.chauhanii叶状体从日龄25 d至50 d的发育过程中,伴随着单孢子的形成和放散。通过观察统计,单孢子的放散量从25 d开始逐渐增加,于35 d处达到峰值后逐渐下降。这期间,Pc-Ca M7基因的相对表达量从日龄25 d起逐步上调,在日龄35 d处达到峰值,为初始量的5倍,从日龄40 d开始下降并保持在初始量的3倍左右。而在不具备单孢子放散能力的坛紫菜中,伴随着叶状体生长过程,Pc-Ca M7的直系同源基因ph00404的表达量在日龄40 d处上调并达到峰值,但仅约为初始量的2倍。因此,通过在P.chauhanii中单孢子的形成和放散与Pc-Ca M7基因表达之间的相关性,以及该基因在两种紫菜中表达模式的差异,暗示Pc-Ca M7基因可能参与了该紫菜的单孢子的形成和放散以及生长发育过程。为了进一步探究Pc-Ca M7基因与P.chauhanii单孢子的形成和放散过程中的关联性,本研究对不同温度和光照培养条件下,以及外源添加尿囊素和过氧化氢培养条件下P.chauhanii的生长情况、单孢子的放散规律以及Pc-Ca M7基因的表达趋势进行了深入分析。结果显示,高温和高光一定程度上能够显著提高Pc-Ca M7基因的表达,而在外源添加10 m M尿囊素和0.5 m M过氧化氢处理条件下,Pc-Ca M7基因也呈现了表达量的显著上调。与此同时,Pc-Ca M7基因的相对表达量与单孢子的形成和放散的相关性再次得到验证,进一步暗示了Pc-Ca M7基因可能参与了该紫菜单孢子的形成和放散过程。本研究为揭示钙离子信号通路在紫菜单孢子的形成和放散过程中的的调控作用奠定基础。


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