花鲈白细胞介素17家族及其受体的克隆与鉴定

【摘要】：花鲈(Lateolabrax maculatus)隶属鲈形目(Perciforms)、鮨科(Servanidae)。白细胞介素17(IL-17)家族是一种细胞因子,他们为一类小分子分泌蛋白,通过与受体特异性结合调控细胞内一系列反应,在先天性免疫和适应性免疫中都起到了重要的作用。本研究中鉴定了花鲈IL-17家族的4个配体(IL-17A/F1、IL-17B、IL-17C、IL-17D)及1个受体(IL-17RB),并应用生物信息学方法分析了他们的分子结构。通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)的方法,分析了5个基因在健康花鲈各组织中的表达情况;分析了爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)感染花鲈后,相关免疫组织(鳃、头肾和脾脏)中5个基因的表达情况;分析了脂多糖(LPS)/聚肌苷酸-聚胞苷酸(poly I:C)刺激花鲈后,对5个基因表达的影响。构建了原核表达载体,获得了花鲈IL-17B及IL-17RB重组蛋白。结果如下:(1)通过克隆获得了花鲈4个IL-17配体及1个IL-17受体c DNA全长。序列分析显示,4个IL-17配体除了IL-17C,预测都有一个信号肽。每个IL-17配体都有4个可形成二硫键的保守半胱氨酸。1个IL-17受体(IL-17RB)也预测出有一个信号肽。IL-17RB为单次跨膜蛋白。(2)通过qRT-PCR分析发现花鲈各个基因在不同的组织中表达水平不同。在健康花鲈鳃、头肾、后肠、脾脏、肝、脑、皮肤和肌肉这8种组织中,都检测到了它们的表达。IL-17A/F1基因在鳃中表达量最高,在肌肉中表达量最低;IL-17B基因在鳃中表达量最高,在肝中表达量最低;IL-17C基因在肌肉中表达量最高,在头肾中表达量最低;IL-17D基因在脑中表达量最高,在肌肉中表达量最低;IL-17RB基因在鳃中表达量最高,在肠中表达量最低。鳃是鱼类抵御病原体入侵的第一道防线,是鱼重要的黏膜免疫器官,大多数IL-17基因在鳃中的高表达表明了它们在黏膜免疫中起了重要作用。IL-17RB与IL-17B基因在各个组织中的表达水平相似,可能与它们的特异性结合有关。(3)qRT-PCR表明,在分别注射LPS、poly(I:C)和爱德华氏菌12h后,花鲈鳃中的IL-17A/F1基因表达量极显著下调,IL-17A/F1基因在每种鱼中表达水平都不同,差异较大,很难分辨出它的具体作用;在分别注射LPS、poly(I:C)和爱德华氏菌6h后,头肾中的IL-17B基因表达量显著上调,表明IL-17B在病原体入侵时迅速反应;在注射LPS的6 h后,头肾中IL-17C表达上调6倍,推测IL-17C可能在炎症初期发挥独特的作用;在注射LPS、poly(I:C)和爱德华氏菌48h后,头肾中的IL-17D显著上调,表明了IL-17D参与炎症反应。在注射爱德华氏菌6h后,头肾中的IL-17RB基因表达量显著上调,这个结果与IL-17B一致。(4)分别构建了花鲈IL-17B及IL-17RB的重组质粒,经过大量诱导后获得了IL-17B及IL-17RB的重组蛋白,并把重组蛋白并进行了纯化,SDS-PAGE显示重组蛋白大小和预测结果一致,为下一步功能实验奠定基础。上述结果表明:花鲈IL-17家族配体及其受体对LPS、poly(I:C)和爱德华氏菌刺激的反应各不相同,表现出不同程度的表达变化,暗示它们在病原体入侵时在免疫系统中发挥了不同的作用。