PU.1在造血细胞分化中的生物学作用研究

【摘要】：PU.1作为ETS家族转录因子,是造血谱系分化过程中的一个关键调控因子,对几乎所有的血细胞谱系的发育都至关重要。PU.1参与造血细胞分化过程,PU.1异常表达会引发多种不同类型的白血病。因此在分子水平上探索PU.1在造血干细胞中的调控机制具有重要的意义。但是目前对转录因子PU.1介导的造血疾病的发病机制和有效治疗靶点仍不清楚,PU.1在细胞分化中的作用并没有进行深入研究。K562细胞可以使用hemin诱导向红系方向分化,因此本研究选择hemin诱导K562细胞定向分化为实验模型。本课题组在之前的研究中使用Ch IP结合q PCR的方法对人类K562细胞中MYB基因的启动子区,上游-34k、-53k、-88k区的组蛋白修饰H3K4me1、H3K27ac富集情况和转录因子GATA1、TAL1、C/EBPβ、c-Jun、PU.1结合情况进行探究。发现hemin诱导分化后MYB表达下调,激活型H3K27ac富集度降低,同时发现C/EBPβ、PU.1结合增多,GATA1、TAL1、c-Jun结合减少。表明MYB调控造血分化受到组蛋白修饰及转录因子的共同调控作用,通过形成loop环与启动子区相互作用。PU.1在K562细胞分化过程中通过与启动子区域的结合互作,对MYB进行了负调控。对小鼠M1细胞中c-myb基因的启动子区,上游-25k、-28k、-56k区的转录因子Hoxa9、Meis1、PU.1、CREB、Cohesin、CTCF结合情况进行探究,发现诱导后-28k区域Hoxa9、Cohesin、CTCF结合减少,PU.1结合增加。表明c-myb调控造血分化受到转录因子的调控作用并与成环有关。充分表明,PU.1是造血谱系分化过程中的关键调控因子,然而目前对于PU.1在K562细胞中的全基因组结合位点变化还没有研究。基于实验室前期研究结果及数据库数据,本研究通过Ch IP-seq技术来检测K562细胞在hemin诱导分化前后PU.1在整个基因组的结合变化情况,进而探索PU.1在分化过程中的调控机制。主要结果如下:1.为了探究K562细胞分化过程中PU.1的作用。本研究选用正常培养和诱导分化(hemin,72h)的K562细胞(一种人慢性髓系白血病细胞系),发现分化后PU.1蛋白表达水平增加。使用针对PU.1的抗体进行Ch IP-seq实验,通过生物信息学分析发现PU.1在K562细胞分化前后发生了变化,分化前PU.1结合位点有3107个,分化后的结合位点有1897个,共有的结合位点有843个,表明分化后PU.1的结合位点减少。分化后PU.1在基因启动子区域的结合比例下降。通过比较各染色体上的PU.1的结合分布,我们发现分化后各染色体上的PU.1结合水平发生显著变化。2.对分化前后PU.1的结合位点进行GO和KEGG富集分析。GO富集结果显示,对照组的PU.1结合基因主要参与细胞成分为中性粒细胞脱颗粒;参与了多种生物学过程包括内吞作用及CBL信号转导调节作用;诱导组的PU.1结合基因主要参与生物学进程包括血小板活化、信号转导及聚集,肌动蛋白动力学对吞噬的调控,血浆脂蛋白间隙,WNT5A依赖于FZD4的内部化作用。KEGG富集分析结果显示PU.1参与调控的通路:与对照组相比,诱导组特有的PU.1结合靶基因富集到的信号通路有生长激素的合成、分泌和运输,MAPK信号通路。两组共有FcγR介导的吞噬作用,破骨细胞分化等信号通路。在很多白血病相关研究中也观察到这些通路的变化。3.为验证Ch IP-seq实验的准确性,分别在MDGA1,ARPC3,YES1,TP53I3,CBLL1,NUP214,NEK8,PTPN2,ZNF225,MRTFA等基因的启动子和基因本体上设计引物,通过Ch IP-q PCR进行验证。验证结果显示Ch IP-q PCR与Ch IP-seq结果一致。4.K562细胞分化前后有1210个差异的PU.1结合位点,对应179个靶基因,其中分化相关的PU.1靶基因包括球蛋白基因、自噬相关基因、micro RNA、非编码RNA以及转录因子。5.Motif分析结果显示,PU.1倾向于去结合ACTTCC特定序列。分化后PU.1结合靶基因的蛋白质互作网络节点的数量明显减少,相互作用明显减弱。综上所述,本研究揭示了PU.1在造血细胞分化中的潜在作用,完善了转录因子在K562细胞中的调控机制,为下一步深入探索转录因子PU.1在造血细胞分化中的作用和调控机制奠定基础。