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日本对虾低温胁迫下生理响应机制研究

于振兴  
【摘要】:日本对虾(Marsupenaeus japonicus)是我国主要的海水对虾养殖种类之一,具有非常重要的经济价值。日本对虾不耐低温,适宜的生长温度为23~32℃,低于10℃时就会出现停止生长和侧倒现象。北方地区冬季温度过低,限制了日本对虾养殖面积的扩大,严重影响其养殖周期,最终限制了北方地区养殖总产量,因此了解日本对虾低温胁迫应答机制,培育出耐低温的新品种,成为解决其产业受限的重要方法。然而,目前有关日本对虾响应低温胁迫的研究尚无文献报道,其应对低温胁迫的机制不甚明确。本研究通过对日本对虾低温胁迫后的转录组和代谢组分析,并结合抗氧化应答和凋亡通路相关基因的发掘和功能分析,以及酶学和组织学等研究,聚焦低温胁迫下日本对虾细胞凋亡、抗氧化应答相关基因的表达模式以及氧化损伤和组织病理变化,解析了日本对虾对低温胁迫的应答机制。主要研究结果如下:1低温胁迫下日本对虾转录组和代谢组分析在转录水平共鉴定出2,543个低温胁迫的差异表达基因(上调1,341,下调1,202)。对差异基因进行富集分析发现,这些基因主要聚集在氧化还原酶活性、单加氧酶活性、催化活性、蛋白质加工的正调控、蛋白质加工的调控等生物学GO簇。KEGG富集分析筛选了参与日本对虾应对低温胁迫的通路(例如过氧化物酶体、氨基酸和核苷酸代谢、乙醚脂质代谢、果糖和甘露糖代谢、赖氨酸降解)。在代谢水平总共鉴定到9,694个离子峰,包括4,904个正离子峰和4,790个负离子峰。进一步分析,共筛选到118个低温胁迫的差异代谢物,其中包括66个上调,53个下调。KEGG富集分析,发现这些差异代谢物主要集中在氨基酸代谢通路。转录组和代谢组联合分析发现,差异基因和差异代谢物与日本对虾应对低温胁迫有关的主要涉及氨基酸代谢、氧化应激、信号转导、免疫系统、膜转运等,说明这些路径是日本对虾应对低温胁迫的重要途径。2低温胁迫下日本对虾的生理响应基于低温胁迫下机体的抗氧化酶和凋亡酶活性变化以及相关基因的相对表达量和组织病理变化研究,阐明了日本对虾低温胁迫下的抗氧化应答和组织损伤。结果显示,日本对虾鳃和肝胰腺的总抗氧化能力、超氧化物歧化酶活性、还原型谷胱甘肽含量总体变化趋势为先下降后升高再降低,而丙二醛含量、半胱氨酸蛋白酶3活性一直呈上升趋势;超氧化物歧化酶和半胱氨酸蛋白酶3基因的相对表达量分别呈现先下降后升高再降低和持续升高的趋势,与各自对应的酶活变化趋势相似;通过组织病理切片发现鳃组织上皮层破坏鳃小片厚度进一步减少,鳃丝出现萎缩,肝胰腺颜色变淡,空泡数量增多且体积增大,基膜破裂,肝小管结构消失,仅见模糊的肝小管轮廓,肝胰腺整体呈浆糊状;电镜切片发现日本对虾的鳃和肝胰腺细胞核固缩,核内染色质呈异染色质化;胞内线粒体数量锐减,许多细胞器呈现空泡化;TUNEL检测发现,随胁迫时间的延长,机体细胞凋亡率显著增加,其中对照组、3h10℃、72h10℃组鳃组织细胞凋亡率分别为2.03%、6.20%、26.27%,肝胰腺细胞凋亡率分别为1.06%、25.65%、42.33%。说明低温胁迫降低了日本对虾的抗氧化能力,破坏了体内环境原有的平衡,进而导致机体出现氧化损伤。3低温胁迫下日本对虾凋亡通路基因的克隆以及功能验证克隆得到日本对虾MjBcl-2基因,其c DNA序列全长为2,432bp,登录号:MW000345。其ORF为726bp,编码一个由241个氨基酸组成的蛋白质,该蛋白预测理论等电点为5.9,分子量为26.8 k Da。与凡纳滨对虾的同源性最高,为98%。构建系统发育进化树显示,其与凡纳滨对虾聚为一支,亲缘关系最近,跟其他无脊椎动物亲缘关系较远。荧光定量分析发现MjBcl-2基因在各组织中均有表达,肌肉中表达量最高,心脏最低。低温胁迫后日本对虾鳃和肝胰腺中P53、MjBcl-2、Caspase-3基因相对表达量皆上调,72h达到峰值。Western blot实验证明了P53和Caspase-3多克隆抗体具有特异性,并且通过P53和Caspase-3蛋白灰度值分析发现其表达量均呈上调趋势。上述结果表明,P53、MjBcl-2和Caspase-3在日本对虾应对低温胁迫过程中可能起着重要作用。


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