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基于转录组学的克氏原螯虾对温度和盐度响应机制探究

骆磊  
【摘要】:克氏原螯虾(Procambarus clarkii),俗称小龙虾,是一种淡水经济类虾,因其肉味鲜美,蛋白含量高,而广受消费者欢迎。近年来,随着我国克氏原螯虾养殖产量的不断增加,养殖面积飞速扩增,产业迅猛发展的同时,也存在一些问题。如市场供需季节性和地域性严重失衡的突出问题,主要表现为长期高低温环境和盐碱地养殖受到制约。因此,开展克氏原螯虾对不同温度和盐度胁迫的响应机制研究,可为后续克氏原螯虾养殖区域扩大和开展反季节养殖提供分子理论基础。本文建立了克氏原螯虾在急性温度和盐度胁迫下的肝胰腺转录组数据库,对关键差异表达基因(DEGs)和显著富集通路进行了筛选与分析。其次,检测了急性温度和盐度胁迫下的克氏原螯虾肝胰腺、鳃组织的免疫、代谢和应激相关酶活指标,观察了急性盐度和温度胁迫下的肝胰腺和鳃组织的显微结构。最后,通过转录组数据库筛选出分别对温度响应和盐度响应的两个基因,进行了生物信息学分析以及探究了它们分别在不同温度和不同盐度胁迫下的组织表达变化。本文主要结果如下:一、利用转录组测序技术构建了克氏原螯虾不同温度胁迫下的转录组数据库,三个不同温度组共获得了421,547,922个原始reads,经过数据过滤后,获得了409,214,520个清洁reads。随后经过拼接和整合共获得了116,432个单基因,随后被NR、NT、KO等数据库注释。其中,在所有基因库中均注释的单基因共有1893个(1.62%),并且在至少一个数据库中注释的单基因有37255(31.99%)个。差异表达基因统计显示,30℃高温组和10℃低温组分别发现了2092个DEGs和6929个DEGs。KEGG通路富集结果表明,免疫途径是克氏原螯虾10℃胁迫后的主要应激途径,代谢途径是30℃处理后的主要响应途径。流式细胞分析还发现了高温和低温胁迫均引起克氏原螯虾血细胞不同程度的凋亡,动态转录热图分析鉴定了HSPs家族基因,免疫相关基因和凋亡途径基因在不同温度胁迫下的差异表达。此外,高温(30℃)和低温(10℃)胁迫下的克氏原螯虾代谢相关酶丙酮酸激酶(PK)、脂肪酸合成酶(FAS)、免疫与抗氧化相关酶溶菌酶(LYS)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和热应激蛋白HSP90的表达量与中温(25℃)对照组相比差异性显著。组织切片分析也发现了高温和低温条件下克氏原螯虾肝胰腺和鳃组织细胞显微结构受到不同程度损伤。二、利用转录组测序技术建立了克氏原螯虾盐度梯度转录组数据库,从15组不同盐度和时间点处理的克氏原螯虾肝胰腺中共获得了882,552,854个清洁reads。经过Trinity软件对清洁reads进行组装后,产生了平均长度为1000bp的52533个单基因。通过blastx程序将52533个单基因比对到Nr、Swiss Prot、KEGG和COG等数据库后,发现被注释的基因总数为16957个,在所有基因库中均注释的单基因共有7748个(14.75%)。差异表达基因统计显示,在15个不同比较组中,低盐24h组与对照组相比DEGs最多,为2545个(1368个上调,1177个下调);DEGs数目最少的为高盐6h和低盐6h比较组,为16个(9个上调,7个下调)。通路富集以及DEGs归类显示,6个盐度处理组与对照组的所有差异表达基因中,糖代谢途径是克氏原螯虾面对盐度胁迫后的最主要反应通路(256个DEGs)。其次为蛋白质和氨基酸代谢(182个DEGs)和免疫与抗氧化途径(165个DEGs)。在信号通路中,MAPK信号通路是起主要作用的通路,不同盐度胁迫下共有64个DEGs。其次为Longevity调控通路,有26个DEGs。此外,FoxO、Hippo、Wnt和Phosphatidylinositol信号通路也参与到了克氏原螯虾应对盐度变化的调控机制中。对溶质载体家族蛋白基因(SLC家族)差异统计情况显示,各比较组中共有90个SLC家族基因参与盐度应激,钠/葡糖糖协同转运蛋白(SLC5A1)基因,Na~+/Cl~-依赖性的神经递质转运蛋白(SLC6A5)基因与锌离子转运蛋白(SLC39A1、SLC39A2)基因为各比较组差异表达基因中出现频率最高且差异倍数较大的4个基因。生化指标探究也表明,克氏原螯虾能量代谢相关酶PK活性、FAS活性以及免疫相关酶LYS活性、CAT活性、SOD活性和应激蛋白HSP90的表达量在急性低盐到高盐胁迫中具有不同的表达趋势,与对照组相比均有不同程度的差异表达。组织学探究还显示了急性高渗环境会造成克氏原螯虾肝胰腺分泌细胞、储存细胞与鳃组织呼吸上皮细胞、微腔血细胞等结构受损,盐度越高,受损越严重,高盐24ppt条件下会造成不可逆的结构损伤。三、从温度和盐度转录组数据库中发掘到了热应激蛋白基因PcHSP27和盐度响应的6-磷酸葡萄糖转运蛋白基因PcSLC37A2,并通过三代测序基因组中获得了基因序列。PcHSP27序列全长3040bp,开放阅读框ORF长2418bp,编码805个氨基酸。PcSLC37A2序列全长2264bp,开放阅读框ORF长1479 bp,编码492个氨基酸。qRT-PCR显示这两个基因在被检测的12个组织(胃、卵巢、肠、精巢、鳃、脑、肝胰腺、触角腺、心脏、神经、肌肉、表皮)中广泛分布。其中,PcHSP27在精巢、肌肉、胃、卵巢中有较高表达,肠中的表达量最高,表明PcHSP27可能在克氏原螯虾消化吸收、生理代谢、生殖发育方面起到重要作用;而PcSLC37A2在胃中表达量最高,表明了克氏原螯虾可能通过胃中SLC37A2基因的高表达来参与糖类的吸收与转运,以维持血糖平衡。急性高、低温胁迫下PcHSP27在肝胰腺与鳃组织中的表达均与常温25℃对照组有显著性差异,在胁迫2h后反应迅速,胁迫96h后,高温组和低温组PcHSP27有不同的表达趋势。慢性温度胁迫4周、8周后,PcHSP27的表达量在肝胰腺和鳃组织中均显著高于对照组,呈上升趋势。急性盐度胁迫下,PcSLC37A2在肝胰腺和鳃组织有不同的表达模式。6ppt盐度下,PcSLC37A2在各时间点的表达量都显著低于对照组,而高盐(18ppt)组只在8h时高于对照组,其余时间点均低于对照组。在鳃组织中,盐度胁迫2h、4h、8h时,高盐组和低盐组与对照组相比PcSLC37A2表达量均有不同程度的下调,随着胁迫时间的延长,表达量又有上升的趋势。慢性盐度胁迫2周、4周时,PcSLC37A2可能已对3ppt盐度产生了适应,表达量较稳定。在9ppt盐度还有持续性高表达,以应对高渗的外部环境。


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