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电针通过调节TLR4信号通路减轻脑缺血再灌注损伤的动物实验研究

孔营楠  
【摘要】:目的:通过观察电针对脑缺血再灌注损伤模型小鼠磁共振信号联合镜下解剖结构的变化、TLR4m RNA含量以及血清炎性因子释放量的影响,USPIO增强MRI影像技术活体监测小鼠炎性损伤的变化,并结合免疫组化、Real time PCR等手段研究电针减轻小鼠脑缺血再灌注损伤炎性反应亚急性期机制。方法:选择健康成年野生型C57BL/6n小鼠30只(20-25g),随机分为三组:假手术组、大脑中动脉栓塞(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)缺血再灌注组、电针(Electroacupuncture,EA)组;选择健康成年Toll样受体4敲除(Toll-like receptor 4 knock out,TLR4 KO)小鼠10只。所有小鼠均采用腹腔注射麻醉,复制Longa式线栓法并在此基础上改变完善来建立小鼠右侧大脑中动脉栓塞缺血再灌注模型,并将成功栓塞小鼠模型做MRI扫描,结束后取血取脑。假手术组小鼠仅把颈总、颈外及颈内动脉分开,栓线不插进血管;MCAO缺血再灌注组小鼠将线栓插进颈内动脉血管10-12mm左右,血流停止流动30min后,再把线栓撤回到远端距颈内外动脉分叉的地方大约10mm,恢复右侧大脑中动脉血流。以上两组均不予电针治疗,每日同EA组同时间固定捆绑刺激,以排除小鼠应激反应出现的结果误差。EA组、TLR4 KO组小鼠造模方式和MCAO缺血再灌注组一样。术后完全苏醒(2小时)以及再灌注48h后的小鼠神经功能活动情况选择Longa5分法评分标准来评价;造模成功后所有小鼠行尾静脉USPIO注射,EA组、TLR4 KO组小鼠行针刺右侧“足三里”穴以及“百会”穴透刺右侧“太阳穴”,30分钟/天,1次/天;造模成功小鼠48h行MRI,扫描结束后取血、取脑。图像上传到后处理工作站,测量T2加权成像(T2 weighted imaging,T2WI)及磁敏感加权成像(Susceptibility weighted imaging,SWI)冠状位梗塞侧与正常侧信号值比值。室温下,先眼眶取血,待全血静置30min后离心,取上层血清,进行相关炎症信号指标(IL-1β、TNF-α)Elisa法检测;再对小鼠取脑,浸入4%多聚甲醛溶液中,然后将脑在分级系列的醇中脱水并包埋在石蜡中。石蜡切片,脑组织神经元结构破坏情况则采取病理HE染色观察;免疫组化染色观察脑组织梗塞区域铁粒子的吞噬情况;Real time PCR法测量脑组织梗塞区域TLR4的m RNA表达量。采用SPSS 21.0软件统计,设定a=0.05为置信水平。结果:(1)小鼠右侧大脑中动脉缺血再灌注模型采用Longa式线栓改良法成功复制,且梗塞面积稳定。造模成功后的神经功能评分结果显示,假手术组与MCAO缺血再灌注组、EA组、TLR4 KO组均有显著差异变化(p0.05);各模型组之间无明显差异变化(p0.05);再灌注48h后神经功能评分结果显示,与MCAO缺血再灌注组比较,EA组神经功能评分有明显差异变化(p0.05);与EA组比较,TLR4 KO组神经功能评分也有显著改变(p0.05);(2)假手术组小鼠炎性因子(IL-1β、TNF-α)与MCAO缺血再灌注组、EA组、TLR4 KO组均有差异(p0.05);(3)EA组小鼠T2WI右边梗塞侧最低信号与左边正常侧间比值与MCAO缺血再灌注组相比,有明显差异变化(p0.05);(4)假手术组小鼠免疫组化染色中见少量小胶质细胞,未见铁颗粒染色;MCAO缺血再灌注组、EA组见到小胶质细胞增加明显、散在分布于细胞间隙的铁颗粒以及少量被小胶质细胞吞噬的铁颗粒。(5)假手术组小鼠通路中TLR4 m RNA表达量与MCAO缺血再灌注组、EA组均有差异(p0.05);(6)假手术组小鼠HE染色未见明显病理组织改变;MCAO缺血再灌注组、EA组可见小鼠缺血脑组织区域神经细胞结构破坏。结论:借助USPIO增强磁共振手段的监测,与病理组织学对照,针刺能够改善小鼠神经功能缺损症状、减少活化的小胶质细胞数量,升高冠状位T2WI负性强化信号值,脑梗塞面积缩小,可能机制为下调TLR4信号通路中TLR4m RNA以及信号相关下游促炎因子IL-1β、TNF-α的表达。


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