核仁蛋白PAK1IP1参与细胞周期进程及核糖体生物发生的调控研究

【摘要】：细胞生长和增殖在生命的整个过程中都受到精密而严格的调控。一个具有正常功能的器官依赖于一个内在的平衡来维持恰当的细胞数目。细胞增殖和死亡就是维持这个内在平衡的具体表现。细胞增殖受到细胞周期各个环节的高度调控,其中G1／S检验点是最主要的调控开关之一。在G1／S期转折点,细胞针对不同的胞内外信号作出反应,促使细胞在周期中做出反应,即细胞分裂、G1期阻滞、生长停滞或者细胞分化等。这个检验点发生任何故障(例如癌基因的激活或者抑癌基因的失活),将会导致不正常的细胞增殖或转化,最终导致癌症的发生。TP53是我们最为熟知的最重要的抑癌基因之一,大约50%以上的人类癌症中存在p53的突变。而剩下50%的癌症也有一部分是由于调节p53蛋白的因子表达或功能异常所致,比如MDM2基因。在大约7%的癌症中,虽然p53基因没有发生突变,但是MDM2基因表达上调使p53蛋白水平下降从而导致肿瘤的发生。正常细胞中p53的蛋白水平主要受到MDM2调控。MDM2通过泛素化p53蛋白,促使其进入细胞质而降解,从而p53蛋白维持在一个相对较低的状态。P53又能结合在MDM2的启动子上,直接激活MDM2的表达,形成一个反馈调节的机制。在遇到不同的生理压力时,比如DNA损伤,促癌基因和核仁的压力(ribosomal stress), MDM2表达下调或者活性被抑制,而导致p53蛋白的稳定并且持续激活使细胞周期阻滞,凋亡,DNA修复或者衰老。 核仁／核糖体压力主要由于rRNA合成和加工以及核糖体组装等核糖体生物发生受到干扰而产生。近年来已经报道,5—氟尿嘧啶、低剂量的放线菌素D、血清饥饿、核仁或者核糖体蛋白的破坏均可以导致核糖体压力而使p53激活。在核糖体压力应答中,有一些核仁蛋白nucleophosmin(NPM), nucleostemin (NS),L5,L11,L23以及S7均能与MDM2蛋白结合而抑制其活性,使p53稳定而活化。因此,核仁蛋白在核糖体生物发生以及将核仁压力的信号传导至p53信号途径中起着非常关键的作用。 PAK1IP1基因包含5个G蛋白β亚基类似结构WD40的重复基序,并与酵母中的Mak11和Skb15蛋白具有高度同源性,且酵母中的这两个蛋白对于细胞的存活是必需的。2007年已有研究报道将小鼠的PAK1IP1异位表达在酵母中能够替代Skb15的功能。2001年曾报道PAK1IP1广泛表达在人类大部分组织中,并能对PAK1信号途径起着负调节作用。PAK1是一个与细胞增值、存活、分裂以及转录相关的激酶,PAK1IP1在哺乳动物细胞中的功能并不清楚。 本实验在前人的实验基础上进行进一步的假设和论证,对PAK1IP1具体生理功能和机制进行了一系列研究。共分为以下三个部分： 1.核仁蛋白PAK1IP1亚细胞定位及其在细胞中表达分析 运用生物信息学网站在线分析,在PAK1IP1的C端(371—389aa)发现一个核／核仁定位信号(KKRKMVEMLEKKRKKKKIK)。于是我们克隆了人类PAK1IP1全长基因,将其连入融合了GFP的真核表达载体中,通过荧光显微镜观察,发现PAK1IP1是一个核仁蛋白,少部分分布在核质而主要聚集在核仁区。通过定点突变的方法构建了一系列PAK1IP1突变体,发现PAK1IP1蛋白C端371-389aa是核定位信号,而3个KKXK序列是其核仁定位必不可少的。 首先我们利用核仁压力诱导化合物5氟尿嘧啶和低剂量放线菌素处理Hela细胞,发现PAK1IP1的蛋白水平随药物剂量依赖性增加,而mRNA水平并不受影响。我们进一步利用胸腺嘧啶脱氧核苷对Hela细胞进行细胞周期的双重阻断法分析,检测到PAK1IP1其转录和翻译水平均呈现细胞周期依赖性变化。PAK1IP1在静止和生长期的细胞中呈现高表达而在增殖分裂细胞中呈现低表达的模式。表明PAK1IP1能感应核仁压力且呈现细胞周期依赖性表达模式。 2. PAK1IP1调节p53稳定性参与细胞周期调控 我们采用了慢病毒表达系统,将PAK1IP1全长及各不同细胞定位的缺失突变体片段连入了pLL3.7慢病毒载体。通过病毒颗粒感染靶细胞,首先我们以细胞计数、MTS细胞活性分析、以及克隆形成的方法检测到过表达PAK1IP1抑制了U20S细胞增殖和活性,同时核仁定位突变体功能与野生型相似,而核定位的突变体并不影响细胞增殖。同时野生型PAK1IP1对克隆形成的抑制作用比核仁定位突变体更明显。为了检测这种细胞增殖的影响是否与细胞中p53表达相关,我们在p53野生型和缺失型细胞系中进一步用克隆形成方法发现过表达PAK1IP1只对p53野生型细胞具有生长抑制的功能。 通过BrdU掺入以及细胞周期分析的方法,我们发现过表达PAK1IP1通过抑制DNA的合成抑制了细胞增殖,推迟了细胞周期G1／S期进程,而在p53被干扰及缺失型细胞中并没有影响。结果表明PAK1IP1的高表达减慢了细胞周期G1／S期进程且呈现p53依赖性的细胞增殖抑制。 进一步的实验中,我们发现PAK1IP1上调了p53及其下游的蛋白水平,该现象也在核仁定位信号突变体过表达的细胞中出现,而没有发生在核定位信号缺失突变体中。为了证明p53蛋白水平上调是由于合成加快或者是降解减缓引起的,我们利用放线菌酮抑制细胞中蛋白合成并观察p53半衰期变化,发现p53在过表达PAK1IP1的细胞中半衰期明显延长了数小时,表明PAK1IP1稳定了p53蛋白水平。通过细胞内免疫沉淀方法证明了不管是内源还是外源的PAK1IP1均能与MDM2相互作用,且在进一步外源基因的转染和泛素化分析中,证明了核定位的而非胞浆定位的PAK1IP1抑制了MDM2对p53的泛素化降解。 3. PAK1IP1参与核糖体生物发生的功能及机理研究 利用慢病毒干扰系统,我们设计了针对PAK1IP1 mRNA的2个shRNA序列,并验证其中shRNA2是有效的。 首先我们通过生长曲线测定,细胞存活能力分析以及克隆形成分析中发现PAK1IP1沉默后非常显著地抑制了细胞增殖。令人惊奇的是,PAK1IP1沉默后对p53野生型细胞和缺陷型细胞均存在生长抑制的能力,但在p53野生型细胞中作用更显著。然后我们通过Western blot和免疫荧光染色方法证明了p53的激活,且发现PAK1IP1沉默同样使细胞周期G1／S期受到阻滞。 由前文得知PAK1IP1能感应核糖体压力而上调,我们想知道是否PAK1IP1沉默后能激活核糖体蛋白-MDM2-p53信号通路,通过蔗糖梯度离心发现在PAK1IP1沉默的细胞中游离的核糖体蛋白L5和L11明显增加,并通过免疫共沉淀得出这些核糖体蛋白与MDM2的相互作用显著增强。这表明了PAK1IP1在细胞中的沉默可能引发了核糖体压力。利用蔗糖密度梯度离心,Northern杂交以及活细胞氚标记示踪分析,我们进一步证实了PAK1IP1在干扰的情况下抑制了28S rRNA的加工,从而减少了60S核糖体的组装。结果表明,PAK1IP1在细胞中的沉默减少了核糖体的组装从而诱发核糖体压力,抑制细胞增殖。 综上所述,我们发现了一个新的能感应核仁压力的核仁蛋白PAK1IP1,该蛋白通过p53-MDM2信号途径参与了细胞周期调控,并揭示了PAK1IP1核仁蛋白表达的平衡在细胞增殖过程中的重要性。该平衡一旦被打破所引发的压力激活了细胞内p53蛋白,从而使细胞周期阻滞。这在一定程度上解释了PAK1IP1在进化过程中所行使的细胞生物学功能,同时也为研究p53信号途径应对核糖体压力时提供了一个重要的证据。