基于纳米材料的电化学DNA生物传感器在快速检测大肠杆菌中的应用和研究

【摘要】：大肠杆菌是人和恒温动物肠道中的常居菌,常随人及动物粪便从体内排出,广泛散播于自然环境中,对水资源造成污染。大部分大肠杆菌没有致病性,但是部分能产生肠毒素,导致肠胃炎等疾病。特别是0157：H7型大肠杆菌会引起腹泻、出血性大肠炎和溶血尿毒症等疾病。在卫生质量的评价和控制中,通常采用大肠杆菌作为指示菌来了解水体的受污染状况,从而评价其质量以保证卫生安全。因此,建立水体中大肠杆菌的快速检测方法,成为环境保护、饮水卫生、食品卫生和流行病学领域中最重要的研究对象之一。 大肠杆菌的传统检测方法主要有稀释平板计数法、多管发酵法、滤膜法等,这些方法虽然结果比较准确,但往往操作繁琐、耗时长,不能满足快速检测的需求。目前,国内外研究人员已经发展一些新方法对大肠杆菌进行快速检测,主要包括酶底物法、聚合酶链法、免疫分析法、电化学方法和荧光法等。这些方法虽然缩短了检测时间,简化了检测流程,但是普遍降低了检测的灵敏度和选择性。因此发展一种既快速,又能保持高灵敏度、高选择性的大肠杆菌检测方法成了专家学者的重点研究方向。 本论文将纳米技术、生物技术与电化学分析技术三者有机结合,制备了基于金纳米多孔膜的电化学DNA生物传感器以快速检测大肠杆菌,检测限低至50 cfu/mL。根据磁性纳米颗粒具有良好的生物兼容性,合成了Fe203@Au复合磁性纳米颗粒,与DNA杂交技术相结合发展了一种快速、灵敏、高选择性的大肠杆菌检测方法,可获得较低的检测限(5 cfu/mL)。运用多壁碳纳米管和Au纳米颗粒制备了基于nanogold/PDDA-MWNTs的电化学DNA生物传感器快速检测大肠杆菌,最低检测限达5 cfu/mL。论文主要包括以下四个部分： 第一章绪论 本章简要介绍了大肠杆菌的生物学特性、致病性以及卫生标准。总结了检测大肠杆菌的传统方法以及酶底物法、聚合酶链反应技术、免疫检测技术和化学发光法等新方法。回顾了纳米材料的特性、制备和表征方法,并就纳米材料在快速检测大肠杆菌中的应用展开了讨论。 第二章基于金纳米多孔膜的电化学DNA生物传感器应用于大肠杆菌检测的研究 本章通过一种简单绿色的方法制备金纳米多孔膜电极,再将巯基修饰的寡核苷酸片段和巯基己醇混合自组装于金纳米多孔膜电极上,从而制备了SH-DNA/MCH混合自组装单层膜修饰金电极。以亚甲基蓝为电化学杂交指示剂,采用差分脉冲伏安法,实现了对大肠杆菌DNA的检测,进而应用于大肠杆菌浓度的测定。由于金纳米多孔膜增大了DNA的固载量和电子传递速率,从而提高大肠杆菌DNA的检测灵敏度；对大肠杆菌进行浓缩和预培养可以进一步提高其检测灵敏度。经过5 h的培养,该修饰电极能检测出50 cfu/mL的大肠杆菌。 第三章基于Fe2O3@Au核壳纳米颗粒的电化学DNA生物传感器的制备及其应用于大肠杆菌检测的研究 本章发展了一种磁性分离技术与电化学DNA检测技术相结合快速检测水体中大肠杆菌浓度的方法。通过盐酸羟胺还原法制备了Fe2O3@Au核壳磁性纳米颗粒,并应用于DNA的固载和分离。在磁性纳米颗粒表面固载了捕获DNA,通过与目标DNA和辣根过氧化酶标记的信号DNA之间的双杂交形成三明治复合物。以TMB和H2O2为酶的共底物,检测到的电流大小与大肠杆菌的DNA浓度成线性关系,从而测定大肠杆菌浓度。Fe2O3@Au磁性纳米颗粒增大了DNA固载量和分离效率,从而提高了传感器选择性和灵敏度；辣根过氧化酶标记大大降低了检测限。实验结果表明,大肠杆菌浓度在1×103～5×105 cfu/mL范围内与电流大小呈线性关系,经过4h的培养,最低检测限达5cfu/mL。此外,对实际水样进行测定,结果与平板技术法相比较,具有良好的一致性。 第四章基于nanogold/PDDA-MWNTs的电化学DNA生物传感器的制备及其在快速检测大肠杆菌中的应用 本章运用多壁碳纳米管和Au纳米颗粒制备了nanogold/PDDA-MWNTs修饰玻碳电极,在其表面固载捕获DNA,通过与目标DNA和葡萄糖氧化酶标记的信号DNA之间的双杂交形成三明治复合物。记录酶催化反应的电化学信号,从而测定大肠杆菌DNA浓度。nanogold/PDDA-MWNTs大大增加了DNA固载量和电子传递速率,提高了检测灵敏度；葡萄糖氧化酶标记进一步减低了检测限。基于nanogold/PDDA-MWNTs的电化学DNA生物传感器应用于大肠杆菌的检测具有较低的检测限(10 cfu/mL)、较宽的线性范围(2.0×103 cfu/mL～2.0×106 cfu/mL)以及良好的重复性,为大肠杆菌的检测提供了一种新方法。