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输血相关病原体灭活及检测技术的研究

张敬敬  
【摘要】:背景输血是现代医学不可或缺的重要支撑条件,但输血也存在着一定的不良反应,受血者遭遇输血不良反应的可能性称为输血风险。输血风险主要由免疫性输血不良反应和感染性输血风险。特别是乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、艾滋病病毒(HIV)等病毒引起的输血传染病给受血者带来的病痛尤为严重。如何降低乃至克服病毒性输血风险,一直是输血医学研究的核心内容之一。随着社会的进步和血液检测技术的发展,输血相关传染性疾病的发生率虽然有了较大幅度地下降,但由于HBV、HCV、HIV等病原体的检测存在“窗口期”漏检且西尼罗河病毒(WNV)、巨细胞病毒(CMV)、人白血病病毒(HTLV)人类疱疹病毒(EB)等多种经血传播病毒未被检测,故仅靠献血者筛选和血液检测并不能完全阻断病毒通过输血感染的途径,杜绝病毒性传染病的根本措施是对血液成分进行病毒灭活。现已研发成功亚甲蓝光化学法(Methylene blue photochemical treatment, MBP)、补骨脂衍生物光化学法、核黄素光化学法(Riboflavin photochemical treatment, RPT)等多种血液成分病毒灭活技术,其中亚甲蓝光化学技术已在我国广泛应用于临床用血浆的病毒灭活,近年核黄素光化学技术在欧洲被获准用于血浆和血小板病毒灭活。亦有个别报道将亚甲蓝光化学方法用于治疗乙型肝炎,使患者血液中HBV的病毒拷贝数大幅降低,病情得到控制,但这一疗法的机理未明。迄今所进行的血液成分病毒灭活研究多聚焦于病毒灭活技术的灭活机制、血液成分病毒灭活的效果及方法学的探讨。尚无经光化学灭活后的病毒对机体免疫功能影响的相关研究报道。目的本研究应用亚甲蓝、核黄素体外光化学病毒灭活方法处理HBV病毒颗粒,将灭活处理前后的HBV与人外周血淋巴细胞(PBMCs)共孵育,探讨不同光化学处理对病毒免疫原性的影响。方法将纯化的含HBV颗粒的HepG2.2.15细胞上清进行亚甲蓝+可见光、核黄素+可见光进行灭活处理,再分别与6份来自健康献血者的人外周血淋巴细胞共孵育,分别设为MB-HBV组和RB-HBV组。将纯化的含HBV颗粒的HepG2.2.15细胞上清与淋巴细胞共孵育组设为HBV组,未处理的淋巴细胞组设为Untreated组。在0h、24h、72h收集上清液,应用ELISA方法检测HBsAg、HBeAg的变化:在24h应用Real-Time PCR方法检测PBMC中抗原递呈细胞(Antigen-presenting Cell, APC)表面与T细胞活化相关的共刺激分子和细胞粘附分子的mRNA水平的变化;在72h应用ELISA方法检测PBMC分泌的细胞因子水平。结果HBV经亚甲蓝光化学病毒灭活后HBsAg和HBeAg均无显著变化(P0.05)。与Untreated组相比,MB-HBV可使分泌量上调14±10倍,IFN-γ分泌量上调12±6倍,但IL-2、IL-4、IL.10的分泌量无上调作用。MB-HBV可显著上调APC表面与T细胞活化相关的共刺激分子和细胞粘附分子的mRNA水平表达(P0.05)。而HBV经核黄素光化学灭活处理后HBsAg无显著性变化(P0.05),HBeAg检测含量显著降低(P0.05),RB-HBV组PBMCs中与T细胞活化相关的共刺激分子和细胞粘附分子的mRNA的表达水平无上调,且RB-HBV组对上述细胞因子的分泌量亦无上调作用。结论HBV经亚甲蓝光化学灭活处理后可刺激PBMC分泌Th]型细胞因子(TNF-a和IFN-γ),具有免疫调节作用。而HBV经核黄素光化学灭活处理后丧失诱导细胞因子分泌的能力,这可能与RB-HBV无法上调APC表面与T细胞活化相关的共刺激分子和细胞粘附分子有关。以上结果也提示这两种病毒灭活方法的机制不尽相同。


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