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GIP衍生物的克隆、表达、纯化及生物学活性研究

宋文程  
【摘要】:葡萄糖依赖性促胰岛素释放肽(glucose-dependent insulinotropic peptide, GIP)又称肠抑胃肽,是一种肠促胰岛素,它能葡萄糖依赖性地促进胰岛素分泌。天然GIP在体内半衰期只有5-7分钟,并无太大的应用潜力。GIP体内半衰期短的主要原因是:GIP会被二肽酶4(DPPⅣ)切割,成为GIP(3-42),并很快失活。此外由于肾小球的滤过作用,GIP被很快清除,这也是其半衰期短的原因。为了获得长效GIP,本研究对其进行了结构改造,并利用基因工程的方法制备获得了GIP及其衍生物,并在动物体内对GIP衍生物的生物学活性进行检测。 鉴于GIP体内活性持续时间较短的主要原因是DPPⅣ的降解,本研究将DPPⅣ的识别位点即第二位的丙氨酸(Ala2)突变成丝氨酸(Ser2),将其命名为mGIP2,这个GIP衍生物能抵抗DPPⅣ的降解,但仍保持GIP的降血糖活性;此外在碳末端增加一个半胱氨酸(Cys),并将其命名为nGIP243。据此设计,本文利用PCR的方法获得天然GIP及衍生物的基因,并将其克隆到大肠杆菌表达载体pET32a (+)中。将筛选得到的正确克隆分别命名为pET32a- nGIP(天然GIP) pET32a- mGIP2、pET32a- mGIP243,抽提质粒并转化到宿主菌E.coli BL21 (DE3)中,得到相应的基因工程菌株。通过优化,得到了工程菌的培养条件及GIP衍生物的纯化方法:将过夜培养的菌体按4%接种量接种,当菌体长到OD600为0.6-0.8时加入异丙基-p-D-硫代半乳糖苷(IPTG)到终浓度为1mmol/L,在37℃,210r/min的条件下继续培养4h,收集菌体;破菌上清经过亲和层析进行纯化,用IDA80可以洗脱大部分杂蛋白,含有硫氧还蛋白的融合蛋白主要在IDA100、IDA200中洗脱,收集并脱盐用于下一步的酶切;纯化的融合蛋白用EK酶在25℃下作用16h,收集IDA20的洗脱产物,即可得到电泳纯的目的蛋白(nGIP、mGIP2和mGIP243)。 动物实验显示,与nGIP相比,mGIP2、mGIP243均表现出较长的体内降血糖活性。特别是mGIP243的降血糖活性持续时间显著延长(p0.01),nGIP在30min时己没有显著的降血糖活性,而mGIP2和mGIP243的降血糖活性分别可持续到30min和90min,mGIP243降血糖效果是mGIP2的3倍。这说明mGIP243不仅可以抵抗DPPⅣ的降解,还可能利用碳末端增加的半胱氨酸与体内白蛋白结合,从而降低了肾小球滤过作用,以此延长其在体内的停留时间。免疫印迹实验显示mGIP243可以在体外没有任何催化剂和辅助的情况下与白蛋白结合,因此可以推测mGIP243在体内可部分以复合物的形式存在,从而延长体内半衰期。通过改造使GIP衍生物nGIP243可能成为治疗糖尿病的候选药物。 然而GIP在肥胖型2型糖尿病人中含量与正常人相似,但不能促胰岛素分泌,而且GIP会使得2型糖尿人后期脂肪积累增加。最新的研究发现,对GIP第三位上的氨基酸突变为脯氨酸(Pro3)时,该衍生物将具有GIP受体拮抗剂的作用,它可以与GIP受体(GIPR)结合,但阻断GIPR信号通路传导。有趣的是,这种拮抗剂可以在高脂饮食诱导的或者肥胖型糖尿病动物中改善代谢异常。本文对nGIP进行突变,将Glu3突变为Pro3,获得GIPR的拮抗剂,命名为pro3GIP。在pro3GIP的碳末端加一个氨基酸Cys,命名为pro3GIPC。利用PCR的方法合成基因,并将其克隆到大肠杆菌载体中,获得的基因工程菌株分别为E.coli BL21(DE3)/pET32a- pro3GIP、E.coli BL21 (DE3)/pET32a- pro3GIPC。按照前述的方法纯化得到相应的多肽pro3GIP和pro3GIPC。 动物实验显示pro3GIPC是GIP的竞争性抑制剂,随着pro3GIPC浓度的增加,其与GIPR结合的能力提高且有着明显的量效关系。当pro3GIPC与mGIP2摩尔比为4:1时可以有效抑制mGIP2的降血糖活性。结果表明pro3GIPC与pro3GIP性质类似,是一种新的GIPR拮抗剂。 糖尿病模型鼠db/db小鼠体内实验显示,在给药11天后小鼠的餐后血糖有了明显的改善,这种效果优于pro3GIP,说明pro3GIPC的体内停留时间更长。停药后,pro3GIPC的血糖控制作用也就消失了,这说明pro3GIPC是以可逆的途径来阻断GIPR信号通路。在给药结束后检测模型鼠的各项生理指标显示,小鼠的糖耐受情况,糖化血红蛋白等都有所改善。用IPGTT实验检测模型鼠的胰岛素敏感性显示,治疗组与对照组相比有明显的改善,胰岛素敏感性显著提高(p0.01)。治疗组的糖化学血红蛋白也较对照组有显著的下降(p0.01),而甘油三酯也有所下调。这都说明pro3GIPC可通过阻断GIPR的信号通路起到改善2型糖尿病代谢异常的作用。通过改造获得的GIPR的拮抗剂pro3GIPC,较pro3GIP效果更佳,为肥胖型糖尿病的治疗提供了一个可选的候选药物。


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