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嘌呤受体P2Y_6在固有免疫中的功能及其机制研究

张智  
【摘要】:嘌呤受体P2Y6(purinergic receptor P2Y, G protein-coupled,6)是P2Y受体家族中的一员,具有典型的7次跨膜结构,属G蛋白偶联受体家族成员。P2Y6受体在免疫器官、心血管系统、神经组织等多种器官和组织中表达,通过其选择性激动剂UDP (uridine 5'-diphosphate)特异性激活PLC,上调细胞内Ca2+浓度,达到传递细胞间信号、调节细胞各种生理功能的目的。研究表明,P2Y6可以通过调节细胞因子IL-8表达促进炎症反应的发生;通过激活NF-κB促进破骨细胞的存活;同时还参与了单核细胞和T淋巴细胞的成熟和分化过程;另外,P2Y6还调节了血管炎症反应,参与心肌细胞纤维化过程,与心血管疾病的发生密切相关。随着研究的不断深入,P2Y6受体有望发展成为重要的药物靶点之一。然而P2Y6的调控功能和相应的分子机制仍有待进一步探索。 巨噬细胞作为固有免疫系统中一种非常重要的效应细胞,广泛分布于身体各种组织,如表皮和黏膜组织,依靠细胞膜上或细胞膜内的模式识别受体PRRs (pattern-recognition receptors),如TLRs (Toll-like receptors)、NLRs (NOD-like receptors)和RLRs (RIG-I-like receptors)等,快速识别病原体阻止感染;清除凋亡、突变和死亡细胞,在抵御外界病原体入侵、维护自身稳定和清除突变细胞中发挥重要作用。巨噬细胞可通过多种方式在固有免疫应答中发挥重要作用,主要表现为分泌细胞因子、招募免疫细胞、吞噬病原体并递呈抗原等功能。在我们前期的研究工作中,采用Q-PCR和Western blot等方法对嘌呤受体P2Y在巨噬细胞中的表达情况进行了分析,结果表明巨噬细胞广泛表达P2Y成员,其中P2Y6在巨噬细胞中呈现出高表达,提示P2Y6可能在巨噬细胞所介导的免疫功能中发挥重要作用。 我们以小鼠巨噬细胞系RAW264.7和小鼠腹腔巨噬细胞为细胞模型,应用P2Y6受体选择性激动剂(UDP)和阻断剂(MRS2578),通过激活或阻断P2Y6受体相关信号通路,研究P2Y6在固有免疫应答中的调控作用及其分子机制。我们发现P2Y6能够促进巨噬细胞中细胞因子/趋化因子的转录表达,进而达到增强单核/巨噬细胞的趋化迁移作用。具体表现在:一、UDP激活P2Y6可以显著提高巨噬细胞中细胞因子/趋化因子的表达,如MCP-1, MIP-lα/β, IFN-α/β, TNF-α以及免疫共刺激分子CD80/86的转录表达;二、UDP刺激巨噬细胞后,其培养上清能明显引起单核细胞/巨噬细胞的趋化迁移,而这种作用能够被P2Y6选择性抑制剂MRS2578所抑制;三、UDP激活P2Y6后可以显著增强巨噬细胞RAW264.7的迁移能力。 在此基础上,我们对P2Y6所参与调控巨噬细胞的信号通路进行了系统分析。Western blot结果显示P2Y6的激活能显著提高MEKl/2、PI3K、STAT1以及IRF3等的磷酸化水平,但对Src和IKK却没有明显作用;磷酸化MEKl/2明显激活ERKl/2通路,而P38及JNK没有显著性变化。应用MAPKs信号通路的专一性抑制剂,如MEK1/2的U0126和PD9805,结合荧光素酶报告基因实验(Luciferase assay)及EMSA技术,发现P2Y6主要通过激活MEKl/2-ERK1/2-AP1相关信号通路,从转录水平上调控了趋化因子MCP-1的表达。此外,P2Y6的激活通过提高IRF3和STAT1磷酸化水平,显著性上调了Ⅰ型干扰素IFN-α/β等的转录表达,这些结果提示P2Y6受体在机体抗感染免疫中发挥着重要作用。 最后,我们通过MCP-1中和抗体实验和小鼠空气泡模型(Air pouch model),进一步确认了P2Y6通过上调趋化因子MCP-1的表达,进而在体内外调控单核/巨噬细胞招募的作用。同时,我们应用GFP标记的E.coil成功建立小鼠腹膜炎模型(Peritonitis),结果表明UDP通过激活P2Y6不仅可以提高局部感染组织对单核/巨噬细胞的招募,还能够显著增强小鼠清除病原体的能力,提高了小鼠的存活率。 综上所述,嘌呤受体P2Y6能够通过MEKl/2-ERKl/2-AP1信号通路的激活,显著提高巨噬细胞中MCP-1等趋化因子的转录表达,在体内提高了单核/巨噬细胞的招募作用,最终达到增强机体抗感染能力,提高宿主存活的目的。本论文的研究为基于G蛋白偶联受体P2Y6的免疫调控药物的开发打下了良好的理论基础。


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