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亚甲蓝光化学法对血液及血制品中淋巴细胞及病毒的灭活效果及其机理

张博  
【摘要】:背景输血是现代医学不可或缺的治疗手段,且随着医学诊疗技术的发展以及社会老龄化程度的提高,临床上对血液的需求持续增加,输血的重要性愈加彰显。然而,输血亦可能发生不良反应,严重的输血不良反应甚至可给受血者带来灾难性的后果。受血者遭遇输血不良反应的可能性称为输血风险,由于输血治疗涉及临床各科,覆盖范围广、其个案累计绝对数相当可观,因此,如何在确保临床输血疗效的同时防范输血风险一直是世界卫生组织、各国卫生行政部门和医学界共同关注的热点问题。 输血风险包括感染性风险及非感染性风险两大类。感染性风险由可通过输血传播的病原微生物构成,其中包括人类免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)等多种病毒以及细菌和原虫等。非感染性输血风险则主要由免疫因素引起的输血不良反应所构成。输血相关的移植物抗宿主病(TA-GVHD)则是后果最为严重的非感染性风险之一,它是由输注了一定数量的具有免疫活性的异体淋巴细胞所引起的致命性输血并发症,目前尚无有效的治疗措施,一旦罹患,死亡率高达90%以上。 血液成分的病原体灭活技术是阻断输血传播病原体,保障输血安全的重要防线。亚甲蓝光化学法是可用于单袋血浆病毒灭活的病原体灭活技术,已在我国和部分欧洲国家应用于临床,其有效性及安全性已得到证实。亚甲蓝是一种带正电荷的小分子化合物,可穿过病毒的包膜与核酸结合,并在吸收可见光提供的能量后发生光化学反应,介导核酸损伤,阻止核酸复制从而导致病原体的灭活。根据这一原理,理论上该方法也同样适用于淋巴细胞的灭活从而达到预防TA-GVHD的目的。该原理还为利用核酸扩增技术评价亚甲蓝病毒灭活效果奠定理论基础。目的1)研究亚甲蓝光化学法对人外周血淋巴细胞在细胞增殖及细胞因子分泌方面的作用,并对淋巴细胞灭活机理进行探讨。2)进一步深入研究亚甲蓝光化学法对病毒的灭活效果及其机理,建立荧光定量PCR技术对亚甲蓝病毒灭活效果的评价方法,并通过无感染性的可度量核酸破坏程度的质控品建立更为安全、有效的病毒灭活效果评价体系。 方法1)向人外周血淋巴细胞中加入终浓度3μM的亚甲蓝,将混匀后的细胞悬液转移至PVC储血袋内并置于4℃病毒灭活箱中,在照射强度为35000lux的荧光光源下照射50min,作为实验组。将淋巴细胞在辐射剂量为25Gy的γ射线下辐照作为辐照组。将处理前后的样品进行淋巴细胞形态、存活趋势、增殖抑制率、细胞因子分泌以及细胞凋亡等检测,分析亚甲蓝光化学作用对淋巴细胞的灭活效果及其机理。2)亚甲蓝光化学法对Sindbis病毒的灭活处理条件如下:a.将病毒悬液于避光条件下加入亚甲蓝,使其终浓度为1μmol/L,将病毒悬液转移至储血袋内并置于4℃病毒灭活照射箱中,在光照强度为15000 lux的荧光光源下照射,分别于光照0、1、3、5、7、10、20、30min时取样检测;b.将病毒悬液于避光条件下加入亚甲蓝,使其终浓度为1μmol/L,将病毒悬液转移至储血袋内并置于4℃病毒灭活照射箱中,分别于光照强度为0 lux、2000 lux、5000 1ux、10000 lux、20000 lux、30000 lux和40000lux的荧光光源下照射5min后取样检测;c.将病毒悬液于避光条件下加入亚甲蓝,使其终浓度分别为0μmol/L、0.1μmol/L 0.5μmol/L、0.7μmol/L、1.0¨mol/L、2.0¨mol/L、3.0μmol/L,将病毒悬液转移至储血袋内并置于4℃病毒灭活照射箱中,在光照强度为15000lux的荧光光源下照射5min后取样检测。每组实验重复3次。所有样品均平行检测其病毒残余滴度并通过定量PCR检测样品中病毒核酸含量,分析病毒感染性的下降与其核酸损伤之间的相关性。向HCV血浆、热力预灭活的Sindbis病毒悬液及HCV病毒样颗粒中加入终浓度1μM的亚甲蓝并将样品转移至储血袋,于4℃病毒灭活箱中在光照强度为35000lux的荧光光源下光照30min,于不同时间点取样并通过定量PCR检测样品中核酸含量,探讨定量PCR技术评价亚甲蓝光化学病毒灭活效果的可行性,同时分析HCV血浆、热力预灭活的Sindbis病毒及HCV病毒样颗粒作为度量病毒核酸破坏程度质控品的可行性。 结果1)亚甲蓝光化学法能够抑制淋巴细胞增殖及其细胞因子分泌。荧光染色及细胞存活趋势结果显示实验组活性细胞数显著低于对照组及辐照组。实验组淋巴细胞在PHA刺激下其增殖集落明显小于其他处理组;PHA刺激后3d、4d、5d的增殖抑制率分别为89.31%、100%和94.39%,均高于辐照组。经PHA刺激后的实验组细胞IFN-γ、IL-1β、IL-4、IL-6和IL-8的分泌量显著低于PHA刺激后的对照组,TNF-α、IL-2和IL-12的分泌量与对照组没有显著性差异;经PHA刺激后的实验组细胞除IL-12外,其余细胞因子的分泌量均显著低于PHA刺激后的辐照组细胞;除TNF-α和IL-8外,PHA刺激的实验组细胞细胞因子分泌量与未经PHA刺激之间无显著性差异。亚甲蓝光化学作用后的淋巴细胞未检测到caspase-3、caspase-6的蛋白活性以及DNA Ladder、未出现明显的磷脂酰丝氨酸外翻,推断亚甲蓝光化学作用导致了淋巴细胞的无序死亡。2)在上述a、b、c三种亚甲蓝光化学灭活处理Sindbis病毒的条件下,Sindbis病毒的灭活效果最终均达6.0 Log TCID50以上,且病毒核酸含量的下降与病毒感染性的消失均具有线性相关性(R20.94),方差分析显示两者间具有极显著的线性相关性(F0.01)。HCV血浆、热力预灭活的Sindbis病毒均与活性Sindbis病毒具有相似的核酸动力学曲线及扩增抑制曲线;HCV病毒样颗粒与HCV血浆具有相似的核酸动力学曲线及扩增抑制曲线,且两者的核酸下降量呈现极显著的线性相关性(R20.99)。结论1)亚甲蓝光化学作用可以有效灭活淋巴细胞,抑制其细胞增殖和细胞因子的分泌(国内首次报道)。2)亚甲蓝光化学作用可导致淋巴细胞的无序死亡(首次发现)。3)亚甲蓝光化学法造成了病毒核酸的损伤,且通过病毒核酸含量下降与病毒感染性消失的平行观察证实核酸是亚甲蓝光化学病毒灭活的主要作用靶点,并为荧光定量PCR技术评价亚甲蓝光化学病毒灭活效果提供依据(国际首次报道,相关论文已发表于Photochemistry and Photobiology杂志)。4)热力预灭活的Sindbis病毒以及HCV病毒样颗粒有望发展成为可度量病毒核酸破坏程度的质控品而应用于亚甲蓝病毒灭活效果的评价体系(国际首次提出)。


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