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尿囊酸酶及其相关基因在盘基网柄菌多细胞发育中的定量研究

梁静静  
【摘要】:社会变形虫盘基网柄菌,其生命世代包括孤立的单细胞阶段和多细胞阶段。饥饿条件下,开始多细胞发育过程,历经疏松聚集、细胞丘、蛞蝓体和子实体四个发育阶段,整个发育周期约24h,且表现出与高等真核生物相似的细胞分化和协作现象。因此盘基网柄菌是研究细胞发育、细胞分化、信号转导、细胞凋亡、吞噬作用、细胞运动等的良好模式动物。 由lagC基因编码的gp150蛋白是细胞粘附分子中的重要蛋白之一。缺失gp150的AK127突变菌株,其多细胞发育过程停留在疏松聚集阶段。本实验室曾运用mRNA差异显示的方法研究盘基网柄菌野生型KAx-3与突变型AK127在多细胞发育阶段基因表达的差异,筛选出尿囊酸酶的基因片段。这就表明在盘基网柄菌中存在尿囊酸酶。尿囊酸酶是嘌呤代谢中一种重要的酶,将尿囊酸催化成尿羟乙酸。动物体内,嘌呤代谢的终产物因物种不同而存在很大差异。为探究盘基网柄菌中尿囊酸酶的功能,本实验室构建以盘基网柄菌中尿囊酸酶基因为靶标的RNAi载体pAct15Gal-allCi,转入野生型细胞KAx-3中,然后用G418抗性筛选阳性克隆,获得突变菌株RNAi-allC。转染形成的菌株在形态发生上与AK127类似,多细胞发育过程被抑制在疏松聚集阶段而不能完成整个发育过程,进一步表明尿囊酸酶蛋白是盘基网柄菌多细胞发育过程中一种不可或缺的蛋白。但该酶是如何在盘基网柄菌多细胞发育中发挥作用,是否涉及到其他重要蛋白,其具体的信号通路如何,尚未见报道。 本文采用免疫共沉淀方法探究盘基网柄菌中与尿囊酸酶相互作用的蛋白,并用质谱分析鉴定其中两个条带,分别为40S ribosomal protein S3(rpS3)和40Sribosomal protein S16(rpS16)。实验室人员采用相同的方法,已经分离出与gp150相互作用的蛋白质40S ribosomal protein S3(rpS3)。实时荧光定量PCR技术对allC、lagC、rpS3和rpSl6基因在盘基网柄菌多细胞发育阶段的表达进行定量研究。结果显示:野生型细胞中,allC与lagC在多细胞发育阶段的表达趋势相同,两基因在达到最大表达量后,分别开始下降。其中allC在16h表达量最大,lagC基因的表达在8h才可以被检测出,并于12h表达量最大;而rpS3和rpS16的表达量总体呈下降趋势。但在突变株细胞AK127和RNAi-allC中,各基因的表达量均低于野生型细胞,且无明显变化趋势,仅在相对较低的范围内波动。由此可见,野生型细胞和各突变株细胞中,各基因在多细胞发育阶段的表达情况明显不同,缺失lagC和干扰allC后对盘基网柄菌中与之相关的基因表达产生了影响。为进一步探究尿囊酸酶蛋白在盘基网柄菌多细胞发育中的作用,使用Western blot技术检测尿囊酸酶蛋白分别在柄细胞和孢子细胞中的表达量。结果表明尿囊酸酶在前柄细胞中的分布多于前孢子细胞中,与gp150分子在前柄细胞和前孢子细胞中的分布情况一致,进一步提示尿囊酸酶参与细胞分化,且与gp150分子关系密切。 本文的实验结果表明,allC与lagC, rpS3和rpS16之间存在某种相互作用,共同参与调节盘基网柄菌的细胞发育和细胞分化,为研究盘基网柄菌中尿囊酸酶的功能提供了进一步的参考资料,对于探究尿囊酸酶所涉及的信号通路也有一定的意义,但这几者之间是否直接关联,详细的信号通路如何,仍需在分子水平上深入研究。


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