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盘基网柄菌发育中尿囊酸酶与gp150蛋白相关性的研究

田莉  
【摘要】:盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)是一种营群居生活的真核生物。由于其结构简单,发育历程与高等动物胚胎发育相似,所以是研究细胞信号转导和细胞发育的好材料。 由lagC基因编码的异嗜性粘附分子gp150,对野生型盘基网柄菌后期多细胞发育至关重要。gp150蛋白还与盘基网柄菌柄细胞的形成密切相关。尿囊酸酶是参与嘌呤代谢的一种重要的酶,在研究gp150功能时我们发现此酶。以上实验结论,均提示我们尿囊酸酶和gp150两种盘基网柄菌多细胞发育至关重要的分子,之间应该存在某些关系。但在错综复杂的生物体发育调控网络中,二者究竟如何相互作用,尚未见报道。 本论文选用野生型盘基网柄菌KAx-3发育至16h的多细胞聚集体,通过免疫共沉淀技术探究与尿囊酸酶相互作用的蛋白,质谱鉴定为40S ribosomal protein S3(rpS3)和40S ribosomal protein S16(rpS16)。实验室人员已发现,gp150蛋白也与40S ribosomal protein S3(rpS3)存在相互作用关系。最初认为rpS3是核糖体小亚基的成分之一。随着研究的深入,发现rpS3蛋白还具备多种调节功能,如可诱导细胞编程性死亡以及参与细胞修复等。笔者初步推测尿囊酸酶蛋白、gp150蛋白与rpS3存在某种关系,从而共同调节盘基网柄菌多细胞发育,这有待于进一步实验证实。 本论文通过Western-blot技术分别检测尿囊酸酶(allantoicase, allC)、gp150蛋白、rpS3在KAx-3细胞和RNAi-allC突变株在24h发育过程中的表达情况。结果表明:野生型盘基网柄菌KAx-3多细胞发育期间,尿囊酸酶在细胞聚集阶段(0h~8h),表达量较低,细胞丘和蛞蝓体阶段(8h~16h)呈显著上升趋势,表达量几乎是细胞聚集阶段的2.5倍,拔顶阶段(16h~20h)又下降,孢子阶段(20h~24h)和细胞聚集阶段表达量相当;gp150在发育至8h开始表达,之后变化趋势与尿囊酸酶相似;rpS3在0h~24h整体呈下降趋势,其中聚集体阶段和蛞蝓体阶段下降幅度尤为明显。RNAi-allC突变株中这三种蛋白几乎都没有表达。总体,尿囊酸酶和粘附分子gp150在细胞发育关键阶段均有较高水平的表达,与之相反,rpS3蛋白在发育关键阶段下降趋势尤为显著。KAx-3多细胞发育结果主要形成两类细胞:孢子细胞和死的柄细胞。已有研究发现gp150蛋白主要调控前柄细胞的发育。由此部分实验结果推测,gp150分子、尿囊酸酶和rpS3有可能共同调控盘基网柄菌的多细胞发育,尤其是柄细胞的发育。因此,有可能是gp150蛋白启动发育,allC是其下游基因,通过其产物氨来间接地影响rpS3的磷酸化,被磷酸化的rpS3由细胞质进入细胞核以影响盘基网柄菌细胞分化和多细胞发育。至于尿囊酸酶是否也像gp150那样与柄细胞形成密切相关,有待于进一步实验研究。 由于尿囊酸酶、gp150蛋白在多细胞发育关键阶段存在相似性变化,且gp150蛋白主要调控前柄细胞的发育,为进一步研究尿囊酸酶的作用,我们选取发育关键阶段:KAx-3菌株发育至16h和18h的聚集体,应用免疫荧光定位的方法研究尿囊酸酶在前孢子细胞和前柄细胞中的分布情况,结果发现尿囊酸酶在前柄细胞中的含量远多于前孢子细胞,这与gp150蛋白的分布情况是一致的,提示尿囊酸酶也有可能参与柄细胞的形成。为进一步证实以上推测,我们又从mRNA水平上应用实时荧光定量的方法分别研究尿囊酸酶在发育至16h和18h的聚集体前孢子和前柄细胞中的表达量,结果与免疫荧光实验结果相一致。两实验结果相互印证,提示gp150蛋白和尿囊酸酶可能通过rpS3来共同调控前柄细胞的形成。至于三者之间更为具体的关系及其具体调控机制还有待进一步研究。


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