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通过DNA family shuffling技术获得植物强耐盐Na~+/H~+逆向转运蛋白基因NHXFS1

张辉  
【摘要】:土壤盐渍化是影响农作物生产和生态环境的一个重要的非生物胁迫因素。培育耐盐植物是促进盐碱地开发、土壤改良和生态治理的有效途径。 为了适应盐胁迫造成的渗透胁迫和离子毒害,植物形成了一系列的防御机制,主要包括渗透调节和重建细胞离子均衡两种策略。在离子平衡方面,植物主要通过液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白将过多的Na区隔化到液泡来消除Na-的毒害,这样既可使胞质酶免受离子毒害,又能提高细胞整体渗透压来促进细胞吸水作用。许多研究表明,将液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白转化到不同的植物中均可以提高植物的耐盐性。 然而在实际应用中,不同植物的液泡膜Na-/H+逆向转运蛋白存在转运活性不高、耐盐性不强的问题,因此如何利用现代分子生物学技术,克隆新的强耐盐基因或对已有基因进行分子进化和改造,无论在提高植物的耐盐性还是有效利用、改造盐碱地等具有非常重要的意义。 DNA家族改组(DNA family Shuffling)技术是目前用于蛋白质、酶和单克隆抗体等体外定向进化的快速高效的分子生物学方法,这一技术在提高酶活性、改变底物专一性和改善蛋白质(酶)的性能等方面具有广泛的应用前景。 本研究在国内外首次利用DNA family shuffling技术对液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因进行定向进化并获得植物强耐盐Na+/H+逆向转运蛋白基因。本研究的工作主要包括四个部分: (1)采用来自模式植物拟南芥、主要粮食作物水稻及观赏植物菊花的液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因为亲本基因(AtNHX1、OsNHX1、DmNHXl),通过DNaseI将亲本基因随机片段化并获取100-200bp的基因片段,进行无引物PCR,自我组装形成大片段,最后在三个亲本基因扩增引物的条件下,扩增出改组基因库。为了筛选有益突变,对改组基因库进行酶切,构建酵母表达载体pYPGE15,进行质膜及液泡膜Na+通道缺失的酵母突变体A enal-4:Δnhx的乙酸锂转化,使改组基因在酵母中进行异源表达以筛选获得活性提高且耐受力增强的液泡膜Na+/H‘逆向转运蛋白基因。通过上述工作,我们成功的获得了一个耐盐性显著提高的新改组基因,命名为NHXFS1。 (2)为了对新基因NHXFS1进行进一步的功能验证,我们对该基因进行测序,并设置不同盐浓度梯度的筛选培养基(APG)平板进行定量的盐度耐受力测定。结果表明,该新改组基因NHXFS1的核酸序列与亲本基因水稻OsNHX1相比,存在4个核苷酸的差异,分别为G185A(第185位由G变为A),T1059A,T1221G,A1517G,在氨基酸序列上的差异分别为G62D,D506G。 酵母功能互补试验证明,转入NHXFS1基因的酵母突变体可以在含350mMNaCl的培养基中生长,而转入亲本基因AtNHX1、OsNHX1及DmNHX1的酵母突变体仅可以在100mM的含盐培养基中生长,证明NHXFS1的产物与亲本基因的产物相比活性提高了3.5倍。同时,表达NHXFS1的酵母比表达OsNHX1的酵母中能富集更多的Na及K‘,但K‘的富集度低于Na+。研究还证明,NHXFS1转化子对LiCl的耐受力高于OsNHX1酵母转化子,但表达两种基因的酵母突变株对KCl的耐受力相当。 同时分别构建了pYPEG15-NHXFS1-EGFP及pYPGE15-OsNHX1-EGFP酵母表达载体,并转化酵母进行异源表达和激光共聚焦显微镜观察。结果显示,NHXFS1与OsNHX1表达的蛋白均定位于酵母液泡及液泡前极囊泡中。 此外,为了研究单个基因的改变对改组基因NHXFS1功能的影响,我们利用PCR介导的定点突变技术对NHXFS1基因进行了点回复突变,分别命名为NHXFS62(G62D)和NHXF506(D506G),并将它们连接到酵母表达载体pPYPGE15中,转入相同基因型的酵母突变体中进行酵母互补实验。结果显示,表达含NHXFS62突变体的酵母盐耐受力比表达NHXFS506的酵母突变株强,但总体上均弱于转NHXFS1的酵母菌。液泡内离子测试实验表明,转NHXFS62的酵母突变株与转NHXFS506的突变株相比含有较高的Na+及K‘。 (3)为了对改组基因表达蛋白进行定量检测,我们通过NHXFS1蛋白序列及抗原性比较,以C-末端序列为模板,构建了NHXFS1蛋白的抗原表达载体pET32a-NHXFS1并将该蛋白表达载体转入大肠杆菌BL21中进行蛋白的扩大培养,获得了高表达量的NHXFS1融合蛋白,通过镍-NTA纯化,成功获得了纯度80%的抗原蛋白。以此蛋白为免疫原对新西兰大白兔免疫进行NHXFS1抗血清的制备,ELISA和western blotting结果证明该抗体的效价达到1:128000且该抗体具有较好的NHXFS1蛋白特异性。 (4)为了验证改组基因NHXFS1对植物耐盐性的影响,我们构建了pGRAB-NHXFS1及pGRAB-OsNHXI农杆菌双元表达载体,转化农杆菌AGL1。利用传统的花序侵染法进行拟南芥的转化,结合除草剂BASTA筛选,获得了相应的转基因苗,通过对转基因苗的PCR检测,我们成功获得了20株OsNHX1转基因苗及25株NHXFS1拟南芥转化子。通过计算孟德尔分离比,鉴定出3株单基因插入的拟南芥转基因苗并对其进行纯合,作为盐处理的材料。 在盐处理条件下,过量表达NHXFS1的拟南芥其生长状况优于过量表达OsNHX1的拟南芥转化子且明显强于野生型苗。对盐处理后的转基因植株及野生型植株进行株高及干鲜重的测量,均证明NHXFS1转基因拟南芥的生长状况好于对照组。Real-Time PCR及western bloting结果显示,外源基因NHXFS1及OsNHX1均在植物体中过量表达,转NHXFS1拟南芥拥有较高的相对水势,植物体内积累更多的Na+、K+及脯氨酸。


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