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基于色谱质谱联用技术的代谢组学方法研究及大肠癌代谢组学研究

成玉  
【摘要】:本论文基于超高效液相色谱质谱联用(UPLC-QTOFMS)技术,探索建立了血清代谢组学方法和人大肠癌组织代谢组学方法。同时,本论文基于色谱质谱联用技术,包括气相色谱飞行时间质谱联用(GC-TOFMS)和UPLC-QTOFMS,进行了人大肠癌尿液样本的代谢组学研究,分析了临床大肠癌患者与正常对照人群尿液样本的代谢谱差异,找到35个重要差异代谢物表征了与大肠癌相关的生物信息变化;并从中进一步筛选出了具有标志代谢物组作用的7个关键代谢物,在训练集和测试集的受试者工作特征曲线(ROC)分析中,曲线下面积AUC分别为0.993和0.998,具有较高的诊断准确性。 主要内容和结果如下: 1、采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间高分辨质谱(UPLC-QTOFMS)联用技术,对血清前处理进行考察和优化,对液质联用分析条件进行优化,建立了适用于血清中广谱小分子代谢物分析(global metabolic profiling)的高通量强耐用的代谢组学分析方法,特别是能满足生物样本数超过400个的大批次代谢组学研究的要求。对最终确定的血清前处理和分析方法进行了方法学考察,结果表明,本方法重现性、精密度及稳定性均良好。对重现性和48小时稳定性考察的检测结果进行变异系数(CV)分析和主成分分析法(Principal component analysis, PCA)的多维分析,证明本方法在代谢组学研究中的可重复性及获得的数据的可靠性良好。 2、采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间高分辨质谱(UPLC-QTOFMS)联用技术,对人大肠癌组织前处理方法进行考察和优化,对液质联用分析条件进行优化,建立了适用于人大肠癌组织中广谱小分子代谢物分析(global metabolic profiling)的高通量强耐用的代谢组学分析方法,特别是能满足生物样本数超过400个的大批次代谢组学研究的要求。对最终确定的前处理和分析方法进行了方法学考察,结果表明,本方法重现性、精密度及稳定性均良好。对重现性和48小时稳定性考察的检测结果进行变异系数(CV)分析,证明本方法在人大肠癌组织代谢组学研究中的可重复性及获得的数据的可靠性良好。 3、采用TMS衍生和气相色谱-飞行时间质谱(GC-TOFMS)联用的代谢组学技术,分析了大肠癌患者和正常对照人群的尿液中代谢谱的差异。利用非监督的PCA方法,能得到大肠癌患者与正常人代谢谱分离的趋势,进一步利用有监督的正交偏最小方差-判别分析(OPLS-DA)的方法能清晰地观察到大肠癌患者与正常对照之间的代谢轮廓的差异,其中包括24例病理分期为Ⅰ期的患者也能与正常人完全分开。 4、采用超高效液相四级杆串联飞行时间质谱联用仪(UPLC-QTOFMS)技术,分析了大肠癌患者与正常对照人群的尿液中代谢谱的差异。实验中得到与基于GC-TOFMS代谢组学分析类似的结果,利用非监督的PCA方法,能得到大肠癌患者与正常人代谢谱分离的趋势,进一步利用有监督的正交偏最小方差-判别分析(OPLS-DA)的方法能清晰地观察到大肠癌患者与正常对照之间的代谢轮廓的差异,其中包括24例病理分期为Ⅰ期的患者也能与正常人完全分开。 5、利用高灵敏度、高选择性和强定性能力的GC-TOFMS和UPLC-QTOFMS两种分析仪器的联合应用,可一次性分析出尿液样本中更多的可鉴定代谢物,在临床大肠癌患者与正常对照人群尿液的代谢谱差异中,研究了35个重要差异代谢物所表征的与大肠癌相关的代谢路径变化,验证了本研究前期研究的结果,确认与大肠癌密切相关的代谢变化包括能量代谢、色氨酸的代谢、酪氨酸的代谢、苯丙氨酸的代谢、尿素循环和多胺代谢以及肠道菌群结构的变化。并从中进一步筛选出了具有标志代谢物组作用的7个关键代谢物,柠檬酸、马尿酸、对甲基苯酚、2-氨基丁酸、肉豆蔻酸、腐胺和犬尿烯酸,在训练集和测试集的ROC分析中,曲线下面积AUC分别为0.993和0.998,具有较高的诊断准确性。不但为监测疾病状况下代谢物的体内变化提供了坚实、可靠的依据,同时为今后治疗大肠癌疾病的药物靶点的寻找提供了可能。 本论文覆盖了不同生物样本的代谢组学方法研究和尿液代谢组学在大肠癌疾病上的应用研究。本论文的研究结果对延伸代谢组学的研究领域将起到一些作用,同时,对于应用代谢组学在大肠癌早期诊断方法的开发方面有可能具有促进作用。


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