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新型电化学免疫传感器的制备及其在食品安全检测中的应用研究

肖飞  
【摘要】:电化学免疫传感器将免疫分析和电化学传感器技术结合,具有体积小、选择性和灵敏度高、响应时间短、所需样品少等特点。电化学免疫传感器在医药工业、环境监测和食品安全检测等诸多领域有着广阔的应用前景。而纳米技术特别是各种具有特殊性质的纳米材料应用于电化学免疫传感器领域后,不仅提高了传感器的检测性能,而且使传感器的各方面性质以及其对生物大分子或者小分子的检测灵敏度显著提高,检测时间也得以缩短,并且可以实现高通量的实时分析检测。 随着中国经济的增长和国民收入的增加和消费观念、健康观念的变化,食品安全问题也逐渐成为公众关注的焦点。近年来,重大的食品安全事件时有发生,严重危害了广大消费者身体健康。因此,开发快速、灵敏、可靠的食品安全检测方法是当前众多科研工作者的重中之重的工作。 本论文的工作主要集中在将纳米技术与电化学免疫分析技术相结合,开发了基于纳米材料的新型电化学免疫传感器,将其应用于食品中有代表性的有毒有害物苏丹红、瘦肉精和氯霉素的检测,并初步探讨了其检测机理。在此基础之上开发了光电化学免疫传感器阵列并应用于食品安全高通量分析。 第一章绪论 本章综述了电化学免疫传感器的原理、分类及其研究进展以及纳米材料在构建电化学免疫传感器过程中的特殊作用。概述了我国食品安全的现状,食品中具有代表性的有毒有害物如苏丹红、瘦肉精和氯霉素的残留危害及其现有的检测技术等等。并在现有检测技术的基础上,提出了本论文研究的内容和意义。 第二章基于单克隆抗体的电化学免疫传感器用于苏丹红Ⅰ号检测的研究 本章工作利用杂交瘤技术制备了苏丹红Ⅰ号单克隆抗体,并将其固定于金电极上首次制备了苏丹红Ⅰ号电化学免疫传感器。将邻巯基苯甲酸(O-MBA)共价键合于金电极表面形成自组装膜(SAM),再利用碳二亚胺偶联法将苏丹红Ⅰ号单克隆抗体固定于自主装膜上。用循环伏安法(CV)研究了传感器制备过程及每步修饰后电极表面性质。所制备的免疫传感器利用电化学交流阻抗法(EIS)在最优条件下对苏丹红Ⅰ号进行了检测,通过苏丹红Ⅰ号和传感器上固定和抗体特异性结合所引起的交流阻抗的变化来测定抗原浓度。检测范围为0.05~50ngmL-1,检测限达到0.03ng mL-1(3σ)。将该方法用于干辣椒粉样品的分析,加标样品回收率在96.50%-107.3%之间。实验结果表明,该研究为苏丹红Ⅰ号检测提供了一种稳定可靠、高灵敏度和高选择性的新方法。 第三章双重信号放大的竞争型免疫传感器的制备及其应用于瘦肉精检测的研究 本章制备了葡萄糖氧化酶(GOD)-克伦特罗(Clenbuterol, CB)功能纳米复合物,并采用共价键合和温育组装等方法构建了双重信号放大的竞争型免疫传感器。研究了GOD催化氧化葡萄糖和普鲁士蓝(PB)催化还原H202双重信号放大的反应机理和传感器检测CB的作用机制。用扫描电子显微镜(SEM)等方法表征了纳米复合材料的形貌和复合物中GOD的活性,复合物中的GOD保持了良好的电催化性能和酶动力学响应,并且符合米氏动力学方程。最佳实验条件下,该免疫传感器对盐酸克伦特罗的检测线性范围为0.01ng mL-1~100ng mL-1,检测限达4.5pg mL-1。实验结果表明,该传感器对瘦肉精克伦特罗的检测具有灵敏度高,特异性强,重现性好,线性范围宽和检测限低等优点。将该方法用于猪肝样品的分析,加标样品回收率在97.50%~102.1%之间。该研究为瘦肉精及p-受体兴奋剂的分析提供了一种新方法。 第四章Cu@Au纳米粒子标记的电化学免疫传感器的制备及应用于克伦特罗检测的研究 本章制备了Cu@Au内米粒子标记的克伦特罗单克隆抗体。用透射电子显微镜(TEM)等方法表征了标记抗体前后Cu@Au内米粒子的形貌和性质。将克伦特罗-羧基化碳纳米管(CB-CMWCNTs)复合物固定于电极表面,再将Cu@Au纳米粒子标记的CB单克隆抗体特异性结合于该复合物上构建了竞争型CB电化学免疫传感器。检测体系中竞争CB浓度越大,传感器表面结合的标记抗体的量越小。将铜@金纳米粒子以Cu2+的形式溶出,采用GC/Nafion/Au修饰电极阳极溶出伏安法(ASV)测定标记物中铜的浓度,从而间接测定竞争克伦特罗的含量。最佳实验条件下,该传感器对克伦特罗的最低检测限可达0.03ng mL-1,且整个检测过程可在2h内完成。将该方法用于猪肝样品中CB的测定,所得结果与传统酶联免疫分析法结果无显著差异。 第五章壳聚糖-空心纳米金球复合膜修饰电化学免疫传感器的制备及其应用于食品中氯霉素残留检测的研究 本章制备了基于壳聚糖-空心纳米金球复合膜修饰的电化学免疫传感器,用将其应用于食品中氯霉素的快速检测。以Co纳米粒子为牺牲模板合成了空心纳米金球(HGNs),并用透射电子显微镜(TEM)表征其形貌和尺寸。采用电化学阻抗谱法(EIS)研究了传感器修饰过程。在最优化实验条件下,壳聚糖-空心纳米金球复合膜修饰的电化学免疫传感器对氯霉素的检测具有较宽的线性范围(0.1~1000ng mL-1),低检测限(0.06ng mL-1)。将该传感器用于肉类食品中氯霉素的检测,所得结果与高效液相色谱法得到的结果一致。该免疫传感器制备方法简单,稳定性好,灵敏度高,选择性好,在食品中氯霉素的检测方面有广阔的应用前景。 第六章基于巯基乙酸包覆CdS量子点的光电免疫传感器阵列制备及其用于兽药残留物多通道分析的研究 本章工作制备了基于巯基乙酸包覆的CdS量子点的光电免疫传感器阵列用于兽药残留物的多通道分析。在该系统中,将聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA),金纳米粒子(Au NPs)和巯基乙酸包覆的CdS量子点层层自主装于自制的金电极阵列上形成(CdS/PDDA/Au NPs/PDDA)n多层膜。并利用电化学交流阻抗谱表征了自组装膜的修饰过程。然后用经典的EDC偶联反应将克伦特罗单克隆抗体、莱克多巴胺单克隆抗体和氯霉素单克隆抗体分别共价键合于金电极阵列上制备了免疫传感器阵列。基于CdS量子点的光电化学效应同时对CB, RAC和CAP进行定性、定量分析。最佳实验条件下,该方法对CB, RAC口CAP的检测限分别可达25,50和2.2pg mL-1(3σ)。将该传感器用于猪肝样品中CB, RAC和CAP分析,回收率在95.40至105.5%之间。实验结果表明,该免疫传感器为兽药残留高通量定性、定量分析提供了一种快速有效的实用分析方法。


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