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ATP生物发光法中虫荧光素酶稳定性的研究

杨桂梅  
【摘要】:近些年来,用于微生物数量检测的方法有很多,包括平板计数、ATP生物发光法、自动化免疫测定、核酸检测等。其中,ATP生物发光法因其灵敏度高,操作简便、检测快速等优点,倍受国内外的关注并已在许多领域得到了广泛的应用。ATP生物发光法是由虫荧光素酶催化荧光素和ATP等发生的生物发光反应,但由于该体系中虫荧光素酶稳定性较差、容易失活,需长期保存在低温的环境中,这在很大程度上限制了其应用价值。因此,开展对提高荧光素酶稳定性方法的研究很有必要。本论文的主要内容包括: (1)为了构建虫荧光素酶的最佳工作环境,本文对荧光素酶的最适缓冲液及pH、反应温度、酶本底背景处理时间、破壁剂的浓度及作用时间进行了研究。结果表明,酶的最适缓冲液为pH为7.8的甘氨酰甘氨酸缓冲液;在常温(23℃)2h内酶活性没有明显降低;新配制好的酶液应在室温下静置30min后使用,降低其本底发光值;苯扎溴铵提取细菌ATP的最适浓度为0.05%,最佳作用时间为3min。 (2)选用实验室菌种(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)对ATP生物发光法和传统平板计数法之间的相关性进行了考察。结果表明,两者用于微生物数量检测的相关性较好,R2达到0.95以上;本实验中所使用的发光检测仪对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最低检测极限OD600nm分别为3.0×10-6和3.0×10-5,对应细菌数分别为2300cfu/ml和3200cfu/ml;此外,还计算得到了大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的ATP含量分别为1.75×10-18mol/cfu和1.16×10-18mol/cfU。 (3)采用玻璃化技术对提高ATP生物发光法中虫荧光素酶的稳定性进行了研究。结果显示:虫荧光素酶玻璃化的最佳保护剂配方为0.4mol/L海藻糖、1000mg/L BSA、800mg/L DEAE-Dx,此时玻璃化后的荧光素酶(简称玻化酶)活性较高,相对发光强度达到94.7%;荧光素酶的玻璃化仪器选择为真空泵;玻化酶的稳定性受保存温度影响较大,低温状况下酶较稳定,常温和高温保存30天后,酶的残留酶活力分别只有65%和4%左右,且ATP检测限也各自下降了1个和3个数量级,需进一步对保护剂配方进行优化,从而提高酶在常温和高温下的稳定性;常温保存18d的玻化酶活性优于-20℃保存的试剂盒荧光素酶,且两者的检测灵敏度一致,由此说明玻化酶的稳定性较好。


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