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原花青素交联脱细胞牛心包膜的性能研究

马兵  
【摘要】:心脏瓣膜病是一种危及生命的疾病,瓣膜置换术是当前治疗末期心脏瓣膜疾病的有效措施。目前,临床上采用戊二醛(Glutaraldehyde, GA)交联制备的生物瓣所进行的瓣膜置换手术成功地延长了大量患者的生命。但是,GA具有细胞毒性,所制备的瓣膜材料容易钙化,最终导致瓣膜的撕裂损坏。 原花青素(Procyanidins, PC)是一种黄酮类物质,主要是儿茶素等的聚合物。广泛存在于许多植物的果实,树皮,叶子和种子中。PC不仅是一种天然的抗氧化剂,它还是一种重要的心血管保护剂。并且它具有抗菌、抗炎症、抗肿瘤等功效。近年来,我们发现PC可交联猪心脏瓣膜细胞外基质,可以提高交联材料的力学性能和稳定性,并有效地抑制钙化的形成。PC与胶原蛋白,或富含脯氨酸的蛋白之间能够形成氢键,从而起到了交联固定胶原蛋白的作用,并且PC自身还可以促进胶原的合成。PC对于细胞的生长没有毒性,而且在适当的浓度还具有促进作用,并具有良好的生物相容性。因此本研究采用PC作为交联剂处理脱细胞牛心包膜细胞外基质(decellularized bovine pericardium extracellular matrix, dbpECMs),通过研究PC交联dbpECMs(PC crosslinked dbpECMs, PC-dbpECMs)以及在不同pH条件下PC交联dbpECMs(pH5.0、pH6.0、pH7.4和pH8.0/PC-dbpECMs)的力学性能,稳定性和生物相容性,探索其用于生物瓣制备材料的可能性。第一部分实验通过研究不同浓度PC交联处理dbpECMs,制备一种性能优越,更加适合用于制备人工心脏瓣膜的生物瓣材料。实验中分别采用1、2.5、5和10mg/mL PC交联dbpECMs48h。研究测定了PC-dbpECMs的力学性能,稳定性和生物相容性等。实验结果显示,2.5mg/mL PC交联能将材料的拉伸强度从29.1MPa提高到51.3MPa,并保持弹性模量基本不变,而抗胶原酶降解能力与戊二醛相当;PC-dbpECMs浸泡于D-Hanks溶液中,仅过量未交联原花青素在一周内释放,而交联的PC在PC-dbpECMs中保持稳定。1mg/mL PC即可基本抑制体外钙化。低浓度PC(如1mg/mL和2.5mg/mL)交联的dbpECMs表面细胞粘附状态良好,适量的PC浓度利于材料表面细胞的粘附增殖,可能对于体内宿主细胞的粘附增殖也具有促进作用。PC-或GA-dbpECMs都具有较好的血液相容性,但PC的交联明显优于GA。2.5mg/mLPC-dbpECMs血小板的粘附率(7.8%)显著低于未交联组(26.1%)和GA交联组(36.6%),表明PC-dbpECMs具有较好的抗血栓形成的能力。巨噬细胞粘附实验和TNF-α浓度检测结果共同显示,PC(≥2.5mg/mL)交联的dbpEMC表面巨噬细胞明显减少,表明PC-dbpEMC能够明显减少其免疫排斥反应,有效地抑制其免疫原性。体外抗凝血性能研究结果显示2.5mg/mLPC-dbpECMs与Non-dbpECMs和GA-dbpECMs相比较,显示出较好的抗凝血性。结果表明PC-dbpECMs具有良好的力学性能,稳定性和生物相容性,有可能成为制备人工心脏瓣膜的优良材料。 在第二部分内容是以第一章研究内容为基础,因为PC1(1mg/mL)浓度交联的dbpECMs各种性能均良好并可以抑制钙化,而且其交联后厚度增加较少,因此选取PC1(1mg/mL)浓度进行以下的研究。实验中采用不同pH条件(pH5.0、pH6.0、pH7.4和pH8.0)交联dbpECMs,以期制备一种更加柔软的心脏瓣膜材料。 实验结果显示,酸性条件下(pH5.0和pH6.0)PC交联的dbpECMs颜色较浅且更加柔顺。与Non-dbpECMs相比,GA-和PC-dbpECMs的厚度均有增厚。但dbpECMs在不同pH条件下进行交联后,pH6.0/PC-dbpECMs和pH8.0/PC-dbpECMs的厚度与PCl-dbpECMs相比明显变薄,且与天然dbpECMs的厚度更加接近。PCl-dbpECMs和pH7.4/PC-dbpECMs均在相同的pH值条件下(pH7.4)交联,其弹性模量基本相同,且均明显高于新鲜的牛心包膜、dbpECMs和GA-dbpECMs。然而,pH6.0/PC-dbpECMs和pH8.0/PC-dbpECMs的弹性模量较小,与dbpECM的弹性模量没有明显的差异。经Ⅱ型胶原酶降解20h后,PC交联的dbpECMs相对重量损失的范围在16%-22%,与GA-dbpECMs (17.69%)没有明显差异。1mg/mL PC可明显抑制体外钙化,而酸性条件下交联的pH6.0/PC-dbpECMs的钙和磷含量(12.46μg/mg和6.64μg/mg)较PC1-dbpECMs明显减少,说明pH6.0/PC-dbpECMs能够进一步抑制钙化的生成。细胞在PC-dbpECMs的表面粘附状态良好,其中pH6.0/PC-dbpECMs表面粘附的细胞数量最多,且细胞形态和粘附情况均较好。PC-dbpEMCs的最大溶血率仅0.5%,低于GA交联ECMs的溶血率(1.029%),显示PC交联的dbpEMCs具有极低的溶血率。pH5.0/PC-dbpECMs和pH6.0/PC-dbpECMs表面粘附的血小板显著减少,表明酸性条件下能有效地抑制血栓的形成。pH6.0/PC-dbpECMs表面巨噬细胞含量最少,且TNF-α浓度也较低,显示酸性条件下,pH6.0/PC-dbpECM的免疫原性明显减小。 综上所述,pH6.0/PC-dbpECMs更加柔顺,且具有良好的力学性能,稳定性和生物相容性。因此在酸性条件下处理的PC-dbpECMs将成为制备人工心脏瓣膜更为优良的材料。


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