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肉碱对鱼类营养代谢的调控机制研究

李加敏  
【摘要】:水产养殖中高脂饲料的应用可起到蛋白节约效应,但高脂饲料也会带来鱼类脂肪的严重沉积,进而影响鱼类生长和健康,因此寻找有效的降脂因子以降低高脂饲料的危害受到鱼类营养学家的重视。哺乳动物的已有研究表明,肉碱通过提升线粒体β-氧化能力,促进脂肪分解。肉碱在鱼类营养研究和养殖实践的应用表明,肉碱在众多鱼类中起到促进生长、降低体脂,甚至节约蛋白的作用。然而在不同鱼类中,肉碱作用效果不同,甚至在一些鱼类中增加了组织脂肪的沉积。由于肉碱降脂的机制不清晰,使得人们不能准确理解肉碱作用的这种矛盾性和复杂性。此外,在生产实践中,肉碱以L-肉碱和D-肉碱两种形式存在,而两者之间在鱼类营养代谢中的功能差异并不十分明确,也使得对不同构型肉碱的选择缺乏确凿的科学依据。以上这些问题的存在,严重限制了肉碱在鱼类养殖中的进一步应用。因此系统地研究肉碱在鱼类营养代谢中的调控机制,为鱼类养殖中添加肉碱以实现降脂和节约蛋白的效果提供必要的理论依据。为此本文通过对斑马鱼饲喂含L-肉碱和肉碱合成抑制剂的饲料,构建高肉碱和低肉碱斑马鱼模型,以研究L-肉碱在鱼类营养代谢中的调控机制;之后,又构建了低肉碱罗非鱼模型,并以此为基础研究不同构型肉碱在鱼类营养代谢中调控功能的差异。1.高肉碱对斑马鱼营养代谢调控的研究本论文首先在斑马鱼中进行L-肉碱调控功能的研究。配制含L-肉碱(500mg/kg BW),且脂肪水平为7%的饲料,饲喂斑马鱼6周以构建高肉碱鱼类模型,然后再分别饱食和饥饿处理一周,通过检测生理生化和分子指标,以系统地研究L-肉碱对鱼类营养代谢的调控作用。对肝脏和肌肉组织中肉碱的含量的检测发现,在两种营养状态下,L-肉碱添加组中肝脏和肌肉的游离型肉碱和总肉碱含量都有明显增加;在两种营养状态下,L-肉碱添加组全鱼总脂无明显变化,但肝脏和肌肉中的甘油三酯含量明显降低。~(14)C标记的棕榈酸测定的结果显示,在两种营养状态下,肝脏和肌肉中线粒体的β-氧化能力得到提升,同时QPCR结果显示肝脏和肌肉中cpt1的转录表达显著上调,脂质合成基因(acc、fas、dgat2)的转录表达受到抑制,而过氧化物酶体的β-氧化能力和关键基因-acox3的表达无变化。本实验检测了糖代谢的相关指标以研究肉碱对糖代谢的调控作用,结果发现,在饥饿状态下,肉碱添加组的全鱼糖原含量显著增加,而两种营养状态下,其肝脏糖异生相关基因的表达和肌肉中糖酵解相关基因的表达分别得到显著的增加和降低。对蛋白代谢相关指标的检测发现,饱食状态下,肉碱添加组的全鱼蛋白含量显著增加,肝脏mtor基因的表达显著上调。本实验同时检测了炎症因子的基因表达,结果显示在饱食和饥饿状态下,肉碱添加组肌肉中促炎因子(tnf-α)和抑炎因子(tgf-β1)的基因表达分别受到抑制和增强。以上实验结果表明,饲料中添加合适的L-肉碱可增加鱼类组织中肉碱含量,进而通过增强线粒体的β-氧化能力以降低体脂,也能够抑制机体对糖的利用,还可通过调控mtor信号通路增加蛋白合成,起到节约蛋白的效应;同时添加L-肉碱也有减少炎症发生的可能。总之,L-肉碱在鱼类营养代谢中发挥着综合性的调控作用。2.低肉碱对斑马鱼营养代谢调控的研究由于肉碱作用的复杂性和矛盾性,且其原因尚不完全清楚,极大地限制了人们对L-肉碱的认识。通过构建肉碱缺乏的鱼类模型,以此为基础研究肉碱功能,将会增强人们对肉碱功能的理解。肉碱合成抑制剂-米屈肼(Mildronate)在哺乳动物中被广泛用于降低组织肉碱含量,构建低肉碱动物模型。本实验首先选择3种不同浓度的米屈肼(100 mg/kg BW,500 mg/kg BW,1000 mg/kg BW)饲喂斑马鱼以构建低肉碱斑马鱼模型,结果发现,3周后3种浓度的米屈肼都可大量减少肝脏中游离肉碱含量和总肉碱含量;而在肌肉中,3种不同浓度的米屈肼对肌肉肉碱含量影响不明显;而对肝脏和肌肉中米屈肼积累量的检测发现,肝脏和肌肉中米屈肼的积累量呈现明显的剂量效应,500 mg/kg BW浓度的米屈肼都可使肝脏中米屈肼积累量达到最高,而肝脏中米屈肼的积累量显著高于肌肉中米屈肼的积累量。因此米屈肼在降低斑马鱼组织肉碱含量呈现出明显的时间和剂量效应,及组织特异性。以上结果充分表明,500mg/kg BW浓度的米屈肼作用3周可成功构建低肉碱鱼类模型。为充分研究米屈肼引起的低肉碱斑马鱼的代谢特征,并以此为基础探讨低肉碱条件下肉碱对鱼类影响代谢的调控功能,本研究开展了第二个实验,饲喂斑马鱼含有500 mg/kg BW浓度的米屈肼、脂肪水平为7%的饲料6周,然后再饱食和饥饿分别处理一周。通过检测组织肉碱含量发现,在饱食和饥饿状态下,米屈肼依然可使斑马鱼肝脏中肉碱含量维持较低水平,但仅在饥饿状态下,可减少肌肉中肉碱含量。因此,米屈肼发挥作用的靶组织是肝脏,而不是肌肉,低肉碱斑马鱼的成功构建是以肝脏的低肉碱状态为基础的。进一步研究结果发现,在两种营养状态下,米屈肼可显著增加肝脏中TG含量,且增加量在50%以上,组织学观察结果也显示肝脏中积累了更多的脂肪。通过检测~(14)C标记的脂肪酸的β-氧化发现,在饱食状态下,米屈肼可抑制肝脏中线粒体的β-氧化能力,体外模拟实验表明,在额外添加L-肉碱状态下,两种营养状态下肝脏的线粒体β-氧化都有显著增加,同时,荧光定量PCR结果显示,在两种营养状态下,米屈肼会增加肝脏脂肪酸β-氧化相关基因(cpt1和ehhadh)的表达,表明斑马鱼线粒体β-氧化的酶活和基因表达水平在低肉碱状态下会有补偿性增加。而对过氧化物酶体β-氧化和关键基因(acox)的表达水平的测定,发现过氧化物酶体并未对低肉碱引起的线粒体β-氧化障碍产生明显反应,提示着斑马鱼的线粒体和过氧化物酶体的协同性可能较弱。脂肪组织脂解基因(atgl和hsl)表达的测定结果发现,不论是在饱食状态下还是饥饿状态下,低肉碱组atgl的基因表达都有上调;对肝脏脂蛋白酯酶(lpl)的基因表达测定结果发现,两种营养状态下,低肉碱组lpl在肝脏组织中的基因表达有显著上调,这提示着斑马鱼的肝脏在面对脂分解代谢受阻引起的能量供应不足时,可通过增加脂肪组织的脂解能力以释放更多的游离脂肪酸至血液中,从而被肝脏吸收,斑马鱼的肝脏和脂肪组织之间良好的协同作用增加了低肉碱肝脏的脂肪负荷,引起更严重的脂肪沉积。同时低肉碱斑马鱼的脂质合成相关基因的表达较弱,表明肝脏脂肪的过多沉积抑制了脂质合成的发生。由于探究鱼类糖脂代谢之间的关系逐渐受到重视,米屈肼可改善哺乳动物的糖代谢,因此本研究检测了糖代谢相关指标,结果发现米屈肼可减少饱食状态下全鱼的糖原含量,增加两种营养状态下的糖代谢效率,荧光定量PCR结果发现米屈肼可增强肝脏糖转运基因(insra)及肝脏和肌肉糖酵解基因(pfk,pk)的表达,抑制肝脏糖异生基因(g6p)的表达。对蛋白代谢相关指标的检测发现,在饱食状态下,米屈肼可增加全鱼蛋白含量和肝脏中蛋白合成基因(mtor)的表达,同时减弱氨基酸分解相关基因(glud1α)的表达。米屈肼引起的低肉碱斑马鱼的研究结果表明:米屈肼在鱼类中发挥作用的主要部位是肝脏而不是肌肉;在低肉碱状态下,肝脏线粒体的β-氧化能力受到抑制,脂肪含量增加,同时存在糖分解增加和蛋白合成增加的可能性。肉碱在鱼类营养代谢中发挥着关键的作用。3.L-肉碱和D-肉碱对尼罗罗非鱼营养代谢调控的不同作用在生产实践中,肉碱是以L-肉碱和D-肉碱两种形式存在的,但在鱼类营养学研究中两者的功能差异并不清晰,因此在当前的实践中,对不同构型肉碱的选择缺乏可靠的学术依据,这进一步限制了肉碱的应用。本实验以罗非鱼为研究对象,通过饲喂含1000 mg/kg BW(25g/kg diet)浓度的米屈肼、7%的脂肪水平的饲料4周,发现罗非鱼血液、肝脏和肌肉中肉碱明显减少,在罗非鱼中成功地构建低肉碱鱼类模型。在此基础上分别投喂含浓度为0.4 g/kg diet的L-肉碱和D-肉碱的饲料,养殖6周,以充分评估L-肉碱和D-肉碱在鱼类营养代谢中功能上的差异。结果发现,L-肉碱组和D-肉碱组肝脏的游离肉碱含量都明显增加,但仅L-肉碱组中肝脏脂酰肉碱含量显著增加;而在肌肉中,L-肉碱组和D-肉碱组的游离肉碱和总肉碱含量均无显著变化,这提示着罗非鱼中L-肉碱和D-肉碱作用的靶组织是肝脏,而不是肌肉。生化和组织学观察结果发现,L-肉碱组的肝脏脂酰肉碱含量有明显增加,肝脏、肌肉和脂肪组织中脂肪含量显著降低,血脂含量显著降低,解毒基因(cyp1a)的表达显著下调。尽管L-肉碱组肝脏cpt1的基因表达无改变,但考虑到低肉碱对鱼类cpt1基因表达有补偿性增加的,L-肉碱组cpt1的转录活性依然维持较高水平,起着促进脂肪分解的功能。因此L-肉碱的添加对低肉碱罗非鱼的脂代谢起到积极的改善作用,降低了低肉碱引起的血脂障碍。而相对于L-肉碱组,D-肉碱组肝脏的脂酰肉碱含量显著下降,解毒基因(cyp1a)的转录表达显著上调。对血清和组织生化指标的检测显示,D-肉碱组血清TG含量显著增加,肝体比(HSI)和脂体比(IPI)增加,肝脏和脂肪组织中的脂肪含量显著升高;组织学结果也显示肝脏和脂肪组织中脂肪沉积增多;荧光定量PCR的结果显示,cpt1和aco的基因表达明显上调,以上结果提示D-肉碱可增加脂肪组织和肝脏的脂肪积累,但肝脏的线粒体和过氧化物酶体存在良好的协同作用。糖代谢相关指标检测显示,D-肉碱组血糖含量和肝糖原无明显变化,但肝脏糖酵解基因(pfk,pk)的转录活性显著上调,糖异生关键基因(fbpa,g6pa)的表达显著下调,这些结果提示肝脏糖代谢较为活跃。对蛋白代谢相关指标的检测显示,D-肉碱组血清总氨酸含量明显增加,但肝脏、肌肉和全鱼总蛋白含量均无显著改变,肝脏中氨基酸分解基因(gcn2)的转录活性显著上调,提示D-肉碱可使氨基酸的分解增加。对炎症反应、氧化应激和凋亡相关指标的检测发现,D-肉碱组肝脏的炎症相关基因(il-1β,tgf-β1)的表达显著增加,血清MDA含量显著增加,肝脏氧化应激相关基因(gst)的表达显著上调,肝脏凋亡相关基因(casp8)表达显著上调,以上结果提示D-肉碱可引起肝脂毒性。为系统地研究D-肉碱和L-肉碱代谢功能的差异,本研究以代谢组学为手段,测定肝脏的代谢物质的变化,结果显示D-肉碱减少肝脏脂酰肉碱含量,增加了磷脂含量,降低了LysoPL含量;D-肉碱也可改变丙酮酸的去路,产生了更多的乳酸和D-柠苹酸;D-肉碱还减少了5种必需氨基酸(缬氨酸,蛋氨酸,亮氨酸,色氨酸和甲硫氨酸)的含量;另外,D-肉碱亦可增加TCA循环的产物-延胡索酸、碳酸和氧化磷酸化的产物-AMP、Pi的含量。总之,以上结果表明:与L-肉碱相比,D-肉碱可减少肝脏脂酰肉碱含量,尽管线粒体和过氧化物酶体的活性得到补偿性增加,但依然增加脂肪的积累,引起肝脂毒性;肝脏通过氨基酸分解而不是糖酵解来产生更多的能量,从而使得TCA循环和氧化磷酸化维持着较高的活力。因此在鱼类营养代谢中,与L-肉碱这种有效的肉碱形式相比,D-肉碱呈现明显消极的作用,不是一种有效的肉碱形式。


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