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铜基纳米酶的制备及其在生物电化学分析中的应用研究

李志  
【摘要】:疾病是威胁健康的元凶,越早的实现检测对于许多常见的重大疾病的治疗越有利,因此对生物标志物的灵敏检测对临床疾病诊断具有巨大的意义。目前应用的生物化学检测方法主要包括免疫法、蛋白组学法、质谱和分子生物学方法等。为了实现待检测物的快速分析和跟踪,生物传感技术应运而生,它结合了分析化学、生命科学、信息学和物理学等众多学科和技术。在生物传感技术中,无论是核酸类传感系统、免疫类传感系统、细胞类传感系统还是微生物类传感系统,信标分子均扮演着非常重要的作用。纳米酶是一类具有催化活性的纳米材料,根据其不同的催化机理可以将纳米酶分为模拟过氧化氢类纳米酶、模拟过氧化物类纳米酶、模拟氧化物类纳米酶、模拟超氧化物类歧化纳米酶和模拟水解物类纳米酶。纳米酶因其优良的催化性能和结构可调控性引起了学者的研究兴趣,其中铜基纳米酶因其铜离子价态间的高效转化,表现出良好的类酶活性。本论文基于生物传感技术,以铜基纳米酶为信标构建不同的检测体系以实现对生物标志物的灵敏检测,对纳米酶在临床检测中的应用进行了探索,具体的内容如下:1.基于双功能化铜离子修饰金属有机框架结构组装电化学传感系统检测细菌内毒素。以2,2-联吡啶-5-羧酸为纳米粒子的棱边,以锆为纳米粒子顶点,制备Ui O-66类型的金属有机框架纳米粒子。随后将铜离子结合在2,2-联吡啶位置,合成了铜离子修饰的金属有机框架纳米粒子。本研究以电化学还原法将石墨烯还原并修饰于电极表面,随后表面结合金纳米粒子作为探针捕获基台,以十八烷基链为细菌内毒素的捕获探针。最后通过铜离子与细菌内毒素的特异结合作用将铜离子修饰的金属有机框架纳米粒子固定于工作界面,通过铜离子的电催化效应实现了检测限为6.1×10~(-4)ng·m L~(-1)的灵敏检测。并且该方法可以实现血清中的细菌内毒素检测。该方法中铜离子不仅作为待测目标的识别单元,也作为电化学信号的产生单元,有效的扩充了双功能化纳米材料的制备与应用范围。2.基于氧化亚铜修饰的还原态石墨烯复合物组装电化学传感器系统检测糖化白蛋白。通过一步还原法将石墨烯和氯化铜同时还原,并得到氧化亚铜修饰的还原态氧化石墨烯,并以此作为电极的修饰材料。以亚甲基蓝修饰的DNA三脚架作为电极表面的第二层修饰单元和糖化白蛋白的识别单元,其中包含糖化白蛋白核酸适配体序列的DNA片段作为DNA三脚架的三个“腿”。当糖化白蛋白与电极表面的DNA三脚架结构结合时,电极表面所产生的亚甲基蓝电化学信号减低,同时更多的氧化亚铜修饰的还原态氧化石墨烯位点暴露,从而引起电极检测液中内标葡萄糖电化学氧化信号的增强。通过两种电化学信号的比值可以在0.02到1500μg·m L~(-1)范围内实现对糖化白蛋白的灵敏检测。该方法将新颖的氧化亚铜纳米酶应用于比率型电化学传感中,并实现了对糖尿病小鼠血清中糖化白蛋白的检测,对临床中糖尿病的筛查具有重要的参考意义。3.基于仿生漆酶修饰的枣核型氧化亚铜复合物组装夹心电化学传感系统检测黏蛋白-1。以枣核状氧化亚铜为中心单元,在其外部修饰结合铜离子的半胱氨酸-组氨酸缩合物(仿生漆酶),最后在复合物表面修饰抗体形成一个具有多重催化位点的免疫信标。将还原态氧化石墨烯、金纳米粒子、黏蛋白适配体和黏蛋白层层组装在电化学传感平台,最后通过免疫结合方式将具有多重催化位点的复合信标结合在黏蛋白-1位点。通过信标的聚集放大效应实现对黏蛋白单体和人乳腺癌细胞(MCF-7)的分别检测。黏蛋白-1浓度在0.5到5000 pg·m L~(-1)范围内具有良好的线性关系,通过计算得出检测限为0.085 pg·m L~(-1)。并且该传感体系可以实现MCF-7浓度在500到5000 cell·m L~(-1)内的灵敏指示。该方法中详细的表征了复合材料的结构,同时铜离子结合于半胱氨酸-组氨酸的二肽结构中,极大的启发了基于氨基酸类纳米酶的合成思路。4.基于二肽缩合铜离子聚集纳米粒子体组装电化学传感系统检测阿尔兹海默氏症淀粉状蛋白β_(42)寡聚体。阿尔兹海默氏症是一种常见的神经退行性疾病,多发生于老年和老年前期,治疗起来的难度较大,各国科学家一直在努力研制特效药。阿尔兹海默氏症被认为是由淀粉状蛋白-β肽聚集形成的寡聚体和淀粉状蛋白原纤维引起的。因此,对淀粉状蛋白β寡聚体的灵敏检测对于阿尔兹海默氏症的诊断和跟踪治疗具有重要的意义。本研究以铜离子和二肽缩合物为原料,高温聚合形成包覆铜离子的肽纳米粒子,接着通过肽链上的羧基连接末端修饰生物素的目标适配体。最后通过链霉亲和素的连接作用,使单个肽纳米粒子聚集成四面体状的纳米颗粒,并将其作为信标分子。该传感平台是在金纳米棒上首先连接特异性识别肽,然后将淀粉状蛋白β_(42)寡聚体捕获在肽位点,最后将制备的信标分子通过适配体固定在电极表面,通过该信标分子对氢醌的电催化信号来实现对淀粉状蛋白β_(42)寡聚体的检测。淀粉状蛋白β_(42)寡聚体浓度在0.01到10 n M范围内具有良好的信号-浓度对应关系,基于三倍信噪比得出的检出限为0.0036 n M,通过实验结果表明该传感系统有较高的灵敏度,良好的特异性和稳定性。


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