拟南芥转运蛋白ABCG18参与灰霉病抗性的表型鉴定及功能分析

【摘要】：在植物发育的不同过程和阶段中,各器官和组织的激素含量具有广泛的差异;此外,固着生长的植物为了免受昆虫和病原体侵害,进化出了对激素合成及转运过程的快速、精准响应机制。ABCG(ATP-binding cassette transporter G subfamily)转运蛋白作为关键的跨膜运输蛋白参与植物激素、脂质、次生代谢物等多种重要底物的转运过程。其中,拟南芥ABCG转运蛋白A-clade中的8个成员(ABCG1/2/6/16/17/18/19/20)因参与重要激素茉莉酸(JA)、脱落酸(ABA)的转运进而影响植物生长发育、生物与非生物胁迫响应等多个过程而受到人们广泛关注。但目前,这8个成员仍存在转运底物鉴定不明确、成员间转运功能的冗余和分化机制不清晰等问题,是领域内研究的热点及难点。本研究以植物重要的真菌病原——灰霉菌(Botrytis cinerea)的抗性筛选为切入点,通过反向遗传学筛选鉴定发现ABCG18参与调控植物灰霉菌抗性,并在此基础上综合运用遗传、生理和代谢等手段进一步解析了ABCG18与ABCG1协同调控叶片中JA含量从而在拟南芥-灰霉菌互作过程中发挥冗余功能的机理。获得的主要结果如下:(1)拟南芥ABCG家族A-clade成员在植物发育及灰霉菌响应过程中可能存在功能冗余及分化。通过分析植物不同发育过程及环境响应相关芯片数据中8个A-clade成员基因的表达信息,结合外施激素及真菌侵染等条件下的q RT-PCR鉴定结果,发现拟南芥ABCG家族A-clade成员在生长发育、激素信号及真菌侵染响应等方面存在时空表达模式上的相似处及分化点,暗示这些成员除存在已报道的冗余功能外,在相关过程中还可能有一定的功能分化。(2)ABCG18在植物灰霉菌抗性过程中发挥重要功能。通过对拟南芥ABCG家族A-clade基因的T-DNA插入突变体进行鉴定,发现ABCG18基因的两个独立突变体abcg18-1、abcg18-11均显示出灰霉菌感病性的显著提高;通过对ABCG18的CRISPR敲除及abcg18-1突变体功能回补遗传材料进行创制和灰霉菌抗性表型鉴定,进一步证实ABCG18在拟南芥灰霉菌抗性过程中发挥着重要的功能。(3)ABCG18与ABCG1在植物发育及环境(激素/灰霉菌)响应过程中可能存在功能冗余。通过对A-clade成员基因启动子-GUS融合转基因植株的构建,结果发现pro ABCG1材料叶片在灰霉菌接种部位显示出了明确的GUS诱导表达信号;与此一致,q RT-PCR的鉴定结果显示,ABCG1的m RNA表达水平在灰霉菌侵染后出现显著变化;此外,虽然abcg1-11突变体的灰霉菌抗性表型与野生型无明显差异,但在外源施加Me JA激素处理及黑暗胁迫处理时,相较野生型,abcg1-11与abcg18-1均出现了叶片衰老加剧和叶绿素含量显著降低的表型,暗示ABCG1和ABCG18存在共同参与转运JA,进一步协同调控拟南芥灰霉菌抗性的可能。(4)拟南芥ABCG18与ABCG1协同调控植物灰霉菌抗性。通过对abcg1-11与abcg18-1突变体进行遗传杂交及加代鉴定,成功构建了abcg18-1*1-11纯合双突变体。在灰霉菌抗性鉴定过程中,与abcg18-1单突变体相比,abcg18-1*1-11双突变体感病性显著提高;此外,通过对莲座叶激素水平进行定量检测发现,相比野生型,abcg18-1中JA含量显著降低,abcg18-1*1-11双突变体中JA含量又较abcg18-1出现进一步降低。以上结果表明,ABCG1与ABCG18可能通过协同转运JA从而在拟南芥叶片灰霉菌抗性过程中发挥冗余功能。综上所述,本研究通过鉴定拟南芥ABCG家族A-clade成员的T-DNA插入突变体,构建获得相关功能回补突变体和CRISPR敲除突变体,结合表型分析验证了ABCG18在拟南芥灰霉菌抗性过程中发挥着重要的功能;且不同于ABCG18与ABCG17存在功能冗余、共同调控ABA长距离运输的已知机制,ABCG18参与的植物灰霉菌抗性过程可能是通过与ABCG1协同转运茉莉酸实现的。本课题的研究不仅鉴定发现了参与植物灰霉菌抗性的新功能基因ABCG18,还进一步揭示了ABCG18作为植物重要激素茉莉酸转运蛋白的可能性,对未来深入阐明茉莉酸介导的植物生长发育及抗性免疫过程相关分子机制具重要意义。