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香蒲细胞色素b5基因的克隆和功能研究

胡光珍  
【摘要】:本论文以香蒲(Typha angustata Bory et Chaub)作为研究材料,从中克隆与TCE(三氯乙烯triehloroethylene)降解相关的基因。植株经过TCE诱导后,提取总RNA,并将其反转录成cDNA。然后,以cDNA作模板进一步合成双链DNA和构建在大肠杆菌中的表达文库。我们首先把文库转化大肠杆菌,筛选能在含有TCE的培养基上生长的克隆。结果我们获得了多个对TCE有较强抗性的克隆。经分离质粒,测序和同源序列比对发现其中有一个是细胞色素b5类似基因XP141。对氨基酸的序列分析表明,它的N端含有一个血红素结合域而C端是一个跨膜结构域。结合前人对细胞色素b5基因的研究结果,我们的初选结果说明香蒲细胞色素b5(XPb5)基因有可能参与TCE的降解。 为了对香蒲细胞色素b5基因的功能展开研究,我们构建了b5基因在酵母中表达的载体pYES2-XP141。以含有pYES2空载体的酵母作为对照,我们研究了XPb5转入对酵母对TCE抗性的影响。实验结果表明:香蒲细胞色素b5也能提高酵母对TCE的抗性。 为了研究香蒲细胞色素b5基因在P450降解TCE的过程中的作用,我们构建了pCW空载体、pCW-XPb5、pCW-CYP1A2/NPR和pCW—XPb5/CYP1A2/NPR等原核表达载体。原核表达实验正在进行中。 最后,为了验证细胞色素b5在植物中也具有分解TCE的功能,我们构建了植物表达载体PJR1一XP141,并已导入到拟南芥和烟草中。通过检测表明,我们获得了多个拟南芥和烟草的转基因株系。纯合型转基因植株及其表型分析正在进行中。


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